浅论肾小管PEA3在肾小管上皮细胞间充质转分化中作用及机制学生
最后更新时间：2024-04-06
作者：用户投稿
本站原创
点赞:8825
浏览:26798
本站原创
点赞:8825
浏览:26798
论文导读：种途径发挥保护肾脏的意义，有效地延缓了糖尿病肾脏纤维化进程。由此，本研宄试图观察ATRA对肾小管上皮细胞间充质转分化的意义并研究其具体意义机制。第一部分：PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达目的观察PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达办法建立如下实验性肾脏病动物模型：顺铂模型、庆大霉素模型、醛固酉同
摘要：随着社会经济的进展和人们生活模式的转变，人类疾病谱正在发生变化，慢性肾脏病（CKD)已呈现流行特点。CKD具有患病率高、医疗费用巨大、易合并心血管疾病而导致病死率和致残率高等特征，目前已成为影响我国国民健康的主要疾病[1]。肾小管间质纤维化是各种理由引起的CKD进展到终末期肾衰竭的共同归路。近年来研宄表明，肾小管间质损伤的严重程度是影响CKD预后的决定因素[2]。由此，如何早期预防和减轻肾小管间质的损伤，是延缓CKD的慢性发展、减轻或消除肾脏纤维化的关键所在，也是肾脏疾病防治战略中最重要的步骤之一。业已证实，上皮细胞和间充质细胞之间可相互改变M。在肾脏胚胎发育期，间充质细胞可改变为上皮细胞，即MET (mesenchymal-epithepaltransition),形成由上皮细胞组成的管样结构，最终逐渐分化并形成肾小管和肾小球；而在成年期，肾小管上皮细胞受到损伤因素刺激后可发生表型改变，由上皮细胞转分化为间充质细胞，造成肾小管间质损伤，最终进展为肾小管间质纤维化。对肾小管间质纤维化的研宄发现，超过1/3的间质成纤维细胞来源于局部肾小管上皮细胞发生的EMT[4]，由此，EMT是导致肾小管间质纤维化的中心环节之一[5’6]。本研宄小组前期运用抑制性差减杂交技术构建新生大鼠和生后21天大鼠肾脏发育差减文库，发现多个拷贝的PEA3基因。PEA3属于Ets癌基因家族成员，其编码蛋白C端含有一个非常保守的Ets结构域，该结构域同时也是DNA结合域。Ets家族蛋白具有调控多种基因表达的意义，包括调控生长、转录、T细胞活化和器官发育等。PEA3主要表达于那些需经历上皮一基质相互诱导发育的组织器官，参与其发育历程[7]。课题组前期研宄发现，PEA3在胚胎肾发育中明显高表达，其通过诱导WH表达进而推动间充质细胞向正常肾组织结构转化，诱导MET，形成由上皮细胞组成的管样结构，最终逐渐分化并形成肾小管和肾小球，该意义与BMP-7在胚胎发育中的意义相似。业已证实，BMP-7可通过阻断肾小管上皮细胞转分化而减轻和延缓肾脏纤维化，且通过TESS启动子分析软件发现BMP-7启动子区有两个PEA3结合位点，由此，我们推测PEA3可能通过上调BMP-7阻断EMT。除此之外，已有文献报道，TGF-f31可从诱导肾小管上皮细胞ROS释放增加，ROS继而增强ad2磷酸化最终加剧EMT的发生[8]。本研宄小组亦发现线粒体功能障碍可从加剧醛固酮诱导的人肾小管上皮细胞EMT，并验证了PGC-1a过表达可从阻断线粒体功能障碍进而抑制EMT。这些为研究EMT的发生机制及干预靶点提供了新的视野。PGC-1a在阻断线粒体功能障碍中发挥极其重要的意义，其最主要的生物学功能是刺激线粒体的生物合成从及增强线粒体的代谢能力，通过刺激线粒体转录因子A (TFAM)的表达调节mtDNA的合成；通过对线粒体核呼吸因子的调节来调节线粒体氧化磷酸化历程，推动ATP的合成；通过激活经典抗氧化酶、UCPs等多条抗氧化防御体系来阻止ROS引起的损伤。于是，我们预想PEA3是否可从通过上调PGC-1a发挥阻断EMT的意义。PEA3在肾小管上皮细胞转分化和肾小管间质纤维化中的意义尚不清楚，由此本研宄拟通过对实验性肾脏病动物模型的观察及体外肾小管上皮细胞培养，研究PEA3在肾小管间质纤维化中的意义极为机制，并对其进行相关干预实验。全反式维甲酸（ATRA)是维生素A的活性代谢产物，在胚胎及成年组织中有多种生物学活性，如在细胞增生、凋亡、分化、生殖、维持细胞正常功能、免疫调节等方面发挥重要意义。近年来全反式维甲酸在肾脏疾病中的意义受到国外学者的关注。多项研宄结果证实，ATRA具有改进肾小球肥大，延缓肾脏纤维化，保护肾功能的意义。但ATRA对于肾脏纤维化的影响尚缺乏深入研宄。已有文献发现全反式维甲酸能够在转录水平上上调BMP-7的表达，推动内源性BMP-7增加，进一步通过与受体结合等多种途径发挥保护肾脏的意义，有效地延缓了糖尿病肾脏纤维化进程。由此，本研宄试图观察ATRA对肾小管上皮细胞间充质转分化的意义并研究其具体意义机制。第一部分：PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达目的观察PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达办法建立如下实验性肾脏病动物模型：顺铂模型、庆大霉素模型、醛固酉同模型、阿霉素肾病模论文导读：加入TGFβ-1刺激，Real-timePCR和WesternBlot检测Smad-1，2，3，5，8和a-A、CTGF、CollagenI(Coll)、E-cadherin、ZO-1表达；（3)采取RNAi技术，构建PEA3siRNA，转染体外培养的HK_2细胞从抑制PEA3表达，再加入TGFβ-1刺激，运用Real-timePCR和WesternBlot检测PEA3及BMP-7mRNA和蛋白表达、Smad-1,2，3，5，8和a-A、CTGF、Coll、
型及UUO动物模型，采取Real-time PCR、western blot及免疫组化的办法，检测PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达变化。结果Real-time PCR、western blot结果显不：UUO模型组较正常小鼠组PEA3表达显著增多；免疫组化结果显示：UU0模型组第七天PEA3表达显著增多，第14天达到高峰，主要表达于肾小球和肾间质细胞，少量表达于肾小管；庆大霉素组PEA3较正常组表达显著升高，于第5天达到高峰，之后逐渐下降，主要表达于损伤的肾小管；阿霉素组较正常组PEA3表达明显增多，主要表达于肾小管；醛固酮模型组以第三天开始肾小球中可见少量PEA3表达，之后逐渐增多，多表达于肾小管和肾小球；顺铂模型(20mg/kg)组较正常组PEA3表达升高，主要见于肾小管。结论随着实验性肾脏病动物模型肾脏纤维化程度加重，PEA3表达逐渐增多，提示该基因可能在肾脏纤维化历程中发挥一定意义；且其表达多见于肾小管及肾小球，提示其可能参与肾小管上皮细胞一间充质细胞转分化的历程。第二部分：PEA3在肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义及机制探讨目的本研宄旨在以实验性肾脏病动物模型中观察到的现象研究PEA3在肾小管上皮细胞一间充质转分化历程中的意义极为可能的机制。办法（1)构建PEA3真核表达载体，转染人肾小管上皮细胞（HK-2)，运用Real-time PCR和Western Blot技术观察该细胞中PEA3和BMP_7mRNA和蛋白表达；（2)过表达PEA3的HK-2细胞，运用TGFβ-1(5ng/ml)刺激或运用BMP-7siRNA预处理后再加入TGFβ-1刺激，Real-time PCR和Western Blot检测Smad-1，2，3，5，8和a-A、 CTGF、 Collagen I (Coll)、 E-cadherin、ZO-1表达；（3)采取RNAi技术，构建PEA3siRNA，转染体外培养的HK_2细胞从抑制PEA3表达，再加入TGFβ-1刺激，运用Real-time PCR和Western Blot检测PEA3及BMP-7mRNA和蛋白表达、Smad-1,2，3，5，8和a-A、CTGF、Coll、E-cadherin、ZO-1表达；(4)体外培养HK-2细胞，运用TGF-^1刺激检测不同时间点线粒体功能障碍的损伤程度；（5)共转染PEA3和PGC-1α siRNA至HK-2细胞，加入TGFβ-1刺激，运用荧光探针2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸（DCFDA)检测细胞内活性氧(R0S)的变化；JC-1检测线粒体膜电位；Real-timePCR检测线粒体DNA拷贝数；Real-timePCR和Western Blot检测PEA3、PGC1_a、TFAM、E-cadherin、Vimentin、ILK禾口a-A的表达状况。结果（1) Real-time PCR和Western Blot结果显示：PEA3过表达组PEA3mRNA和蛋白表达显著升高，且PEA3过表达可上调BMP-7mRNA和蛋白表达；（2)HK-2细胞加入TGFβ-1刺激后，a-A, CTGF和Coll表达及ad2/3磷酸化明显增多，而E-cadherin和Z0-1表达从及adl/5/8磷酸化降低；PEA3过表达后明显抑制TGFβ-1诱导的a-A, CTGF和Coll表达及ad2/3磷酸化，并上调E-cadherin和Z0-1表达及adl/5/8磷酸化；共转染PEA3和BMP_7siRNA的HK-2细胞加入TGFβ-1刺激，BMP-7siRNA明显降低了PEA3对TGFβ-1的保护意义；(3)HK-2细胞转染PEA3siRNA后，PEA3表达明显下降，其抑制率达50%。PEA3siRNA转染组BMP-7mRNA和蛋白表达均明显降低，该组再加入TGFβ-1刺激，较未加入PEA3siRNA预处理组，a-A、CTGF、Coll、ad2/3磷酸化增多，E-cadherin, ZO-1、adl/5/8磷酸化减少;(4) TGFβ-1可诱导HK-2细胞发生线粒体功能障碍；（5) PEA3过表达可上调PGC-1α和TFAM表达，并缓解TGF-β-1诱导的线粒体功能障碍；转染PGC-1α siRNA后减弱了PEA3对TGF论文导读：加入ATRA刺激后，运用虫荧光素酶活性检测法检测BMP-7启动子的活性，Real-timePCR和WesternBlot检测BMP-7表达，WesternBlot检测Smadl/5/8磷酸化；(4)HK-2细胞转染BMP-7siRNA后再加入ATRA和TGFβ-1处理，运用Real-timePCR和WesternBlot检测E-cadherin、ZO-1、a-A、Coll和CTGFmRNA和蛋白表达;(5)将BMP-7启动子和虫荧光素酶
β-1诱导的线粒体功能障碍和EMT的保护意义。结论PEA3可通过上调BMP-7表达而部分阻断TGFβ-1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化；PEA3可通过上调PGC-1α缓解TGFβ-1诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍进而部分阻断TGF-1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化。第三部分：PEA3在全反式维甲酸阻断肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义目的研究全反式维甲酸对肾小管上皮细胞间充质转分化的影响及机制研宄，并观察PEA3在该历程中发挥的意义。办法（1)体外培养HK-2细胞，运用ATRA预处理30分钟后再加入TGF-旦1刺激48h，运用Real-time PCR禾口Western Blot检测EMT相关分子E_cad-herin、ZO-1、a-A、Coll和CTGFmRNA和蛋白表达;(2)予UUO小鼠ATRA处理，Real-time PCR和Western Blot检测TGF-、E-cadherin、ZO-1、a-A、Coll和CTGF mRNA和蛋白表达；(3)体外培养HK-2细胞，构建BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒，转入HK-2细胞，加入ATRA刺激后，运用虫荧光素酶活性检测法检测BMP-7启动子的活性，Real-time PCR和Western Blot检测BMP-7表达，Western Blot检测Smadl/5/8磷酸化；(4) HK-2细胞转染BMP-7siRNA后再加入ATRA和TGFβ-1处理，运用Real-time PCR和Western Blot检测E-cadherin、ZO-1、a-A、Coll和CTGF mRNA和蛋白表达;(5)将BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒转染至HK-2细胞，分别过表达和干扰RARa和RXRa基因，加入ATRA刺激细胞24h，检测荧光素酶活性；（6)运用Western Blot检测不同剂量ATRA刺激细胞后PEA3的表达变化，如上调，再运用Chip检测ATRA与PEA3的结合状况；将BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒转染至HK-2细胞，分别过表达和干扰PEA3，加入ATRA刺激细胞24h，检测荧光素酶活性；（7)运用Chip检测RARa与PEA3结合状况，分别转染RARa质粒、RXRa质粒、PEA3siRNA后，加入ATRA刺激，检测BMP-7荧光素酶活性。结果（l)ATRA显著呈剂量依赖性地抑制TGFβ-1诱导的EMT，即抑制TGF-β-1诱导的a-A、Coll和CTGF表达而上调E-cadherin和Z0-1表达；（2)Real-time PCR和Western Blot研宄结果表明，UU0小鼠肾组织中TGF-e、a-A,ColI和CTGF表达明显上调，而E-cadherin和Z0_1表达则明显下降，ATRA处理后显著抑制UU0的纤维化；（3) ATRA呈剂量依赖性上调BMP-7启动子活性，推动BMP-7mRNA和蛋白表达，同时我们还发现，ATRA明显推动了Smadl/5/8磷酸化，提示ATRA可活化BMP-7/adl，5，8信号通路。（4) BMP_7siRNA阻断ATRA对EMT的抑制意义，BMP-7siRNA推动了a-A, Coll和CTGF表达而抑制E-cadherin和Z0-1表达。(5)过表达RAR a和RXR a后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性增多，且RARa和RXRa共过表达组，增多最显著，反之，RARa和RXRa干扰后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性降低，且RAR a和RXRa共干扰组，降低最显著；（6)过表达PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性增多，反之，干扰PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性降低；（7)ATRA受体RAR a可与PEA3直接结合，且RAR a、RXR a与PEA3可共同意义于ATRA诱导BMP-7表达的历程。结论体内及体外实验均提示ATRA可从阻断肾小管上皮细胞间充质转分化，且可能通过PEA3/BMP-7/adl，5，8信号途径发挥保护意义。关键词：PEA3论文BMP-7论文PGC-1α论文肾小管上皮细胞间充质转分化论文全反式维甲酸论文
本论文由www.7ctime.com论文导读：摘要5-11Abstract11-18前言18-27第一部分PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达27-45前言27-28材料和办法28-39结果39-43讨论43-45第二部分PEA3在肾小管上皮细胞间充质转分化中的意义及机制研宄45-71前言46-49材料和办法49-56结果56-65讨论65-71第三部分PEA3在全反式维甲酸阻断肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义
,需要可从关系人员哦。摘要5-11
Abstract11-18
前言18-27
第一部分 PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达27-45
前言27-28
材料和办法28-39
结果39-43
讨论43-45
第二部分 PEA3在肾小管上皮细胞间充质转分化中的意义及机制研宄45-71
前言46-49
材料和办法49-56
结果56-65
讨论65-71
第三部分 PEA3在全反式维甲酸阻断肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义71-91
前言72-73
材料和办法73-81
结果81-87
讨论87-91
全文小结91
创新之处及特征91-92
参考文献92-103
英文缩略词103-104
综述104-120
上皮细胞间充质转分化与肾脏纤维化探讨104-112
参考文献108-112
H小管间质损伤与慢性肾脏病的探讨发展112-120
参考文献116-120
附录120-148
致谢148-149
摘要：随着社会经济的进展和人们生活模式的转变，人类疾病谱正在发生变化，慢性肾脏病（CKD)已呈现流行特点。CKD具有患病率高、医疗费用巨大、易合并心血管疾病而导致病死率和致残率高等特征，目前已成为影响我国国民健康的主要疾病[1]。肾小管间质纤维化是各种理由引起的CKD进展到终末期肾衰竭的共同归路。近年来研宄表明，肾小管间质损伤的严重程度是影响CKD预后的决定因素[2]。由此，如何早期预防和减轻肾小管间质的损伤，是延缓CKD的慢性发展、减轻或消除肾脏纤维化的关键所在，也是肾脏疾病防治战略中最重要的步骤之一。业已证实，上皮细胞和间充质细胞之间可相互改变M。在肾脏胚胎发育期，间充质细胞可改变为上皮细胞，即MET (mesenchymal-epithepaltransition),形成由上皮细胞组成的管样结构，最终逐渐分化并形成肾小管和肾小球；而在成年期，肾小管上皮细胞受到损伤因素刺激后可发生表型改变，由上皮细胞转分化为间充质细胞，造成肾小管间质损伤，最终进展为肾小管间质纤维化。对肾小管间质纤维化的研宄发现，超过1/3的间质成纤维细胞来源于局部肾小管上皮细胞发生的EMT[4]，由此，EMT是导致肾小管间质纤维化的中心环节之一[5’6]。本研宄小组前期运用抑制性差减杂交技术构建新生大鼠和生后21天大鼠肾脏发育差减文库，发现多个拷贝的PEA3基因。PEA3属于Ets癌基因家族成员，其编码蛋白C端含有一个非常保守的Ets结构域，该结构域同时也是DNA结合域。Ets家族蛋白具有调控多种基因表达的意义，包括调控生长、转录、T细胞活化和器官发育等。PEA3主要表达于那些需经历上皮一基质相互诱导发育的组织器官，参与其发育历程[7]。课题组前期研宄发现，PEA3在胚胎肾发育中明显高表达，其通过诱导WH表达进而推动间充质细胞向正常肾组织结构转化，诱导MET，形成由上皮细胞组成的管样结构，最终逐渐分化并形成肾小管和肾小球，该意义与BMP-7在胚胎发育中的意义相似。业已证实，BMP-7可通过阻断肾小管上皮细胞转分化而减轻和延缓肾脏纤维化，且通过TESS启动子分析软件发现BMP-7启动子区有两个PEA3结合位点，由此，我们推测PEA3可能通过上调BMP-7阻断EMT。除此之外，已有文献报道，TGF-f31可从诱导肾小管上皮细胞ROS释放增加，ROS继而增强ad2磷酸化最终加剧EMT的发生[8]。本研宄小组亦发现线粒体功能障碍可从加剧醛固酮诱导的人肾小管上皮细胞EMT，并验证了PGC-1a过表达可从阻断线粒体功能障碍进而抑制EMT。这些为研究EMT的发生机制及干预靶点提供了新的视野。PGC-1a在阻断线粒体功能障碍中发挥极其重要的意义，其最主要的生物学功能是刺激线粒体的生物合成从及增强线粒体的代谢能力，通过刺激线粒体转录因子A (TFAM)的表达调节mtDNA的合成；通过对线粒体核呼吸因子的调节来调节线粒体氧化磷酸化历程，推动ATP的合成；通过激活经典抗氧化酶、UCPs等多条抗氧化防御体系来阻止ROS引起的损伤。于是，我们预想PEA3是否可从通过上调PGC-1a发挥阻断EMT的意义。PEA3在肾小管上皮细胞转分化和肾小管间质纤维化中的意义尚不清楚，由此本研宄拟通过对实验性肾脏病动物模型的观察及体外肾小管上皮细胞培养，研究PEA3在肾小管间质纤维化中的意义极为机制，并对其进行相关干预实验。全反式维甲酸（ATRA)是维生素A的活性代谢产物，在胚胎及成年组织中有多种生物学活性，如在细胞增生、凋亡、分化、生殖、维持细胞正常功能、免疫调节等方面发挥重要意义。近年来全反式维甲酸在肾脏疾病中的意义受到国外学者的关注。多项研宄结果证实，ATRA具有改进肾小球肥大，延缓肾脏纤维化，保护肾功能的意义。但ATRA对于肾脏纤维化的影响尚缺乏深入研宄。已有文献发现全反式维甲酸能够在转录水平上上调BMP-7的表达，推动内源性BMP-7增加，进一步通过与受体结合等多种途径发挥保护肾脏的意义，有效地延缓了糖尿病肾脏纤维化进程。由此，本研宄试图观察ATRA对肾小管上皮细胞间充质转分化的意义并研究其具体意义机制。第一部分：PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达目的观察PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达办法建立如下实验性肾脏病动物模型：顺铂模型、庆大霉素模型、醛固酉同模型、阿霉素肾病模论文导读：加入TGFβ-1刺激，Real-timePCR和WesternBlot检测Smad-1，2，3，5，8和a-A、CTGF、CollagenI(Coll)、E-cadherin、ZO-1表达；（3)采取RNAi技术，构建PEA3siRNA，转染体外培养的HK_2细胞从抑制PEA3表达，再加入TGFβ-1刺激，运用Real-timePCR和WesternBlot检测PEA3及BMP-7mRNA和蛋白表达、Smad-1,2，3，5，8和a-A、CTGF、Coll、
型及UUO动物模型，采取Real-time PCR、western blot及免疫组化的办法，检测PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达变化。结果Real-time PCR、western blot结果显不：UUO模型组较正常小鼠组PEA3表达显著增多；免疫组化结果显示：UU0模型组第七天PEA3表达显著增多，第14天达到高峰，主要表达于肾小球和肾间质细胞，少量表达于肾小管；庆大霉素组PEA3较正常组表达显著升高，于第5天达到高峰，之后逐渐下降，主要表达于损伤的肾小管；阿霉素组较正常组PEA3表达明显增多，主要表达于肾小管；醛固酮模型组以第三天开始肾小球中可见少量PEA3表达，之后逐渐增多，多表达于肾小管和肾小球；顺铂模型(20mg/kg)组较正常组PEA3表达升高，主要见于肾小管。结论随着实验性肾脏病动物模型肾脏纤维化程度加重，PEA3表达逐渐增多，提示该基因可能在肾脏纤维化历程中发挥一定意义；且其表达多见于肾小管及肾小球，提示其可能参与肾小管上皮细胞一间充质细胞转分化的历程。第二部分：PEA3在肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义及机制探讨目的本研宄旨在以实验性肾脏病动物模型中观察到的现象研究PEA3在肾小管上皮细胞一间充质转分化历程中的意义极为可能的机制。办法（1)构建PEA3真核表达载体，转染人肾小管上皮细胞（HK-2)，运用Real-time PCR和Western Blot技术观察该细胞中PEA3和BMP_7mRNA和蛋白表达；（2)过表达PEA3的HK-2细胞，运用TGFβ-1(5ng/ml)刺激或运用BMP-7siRNA预处理后再加入TGFβ-1刺激，Real-time PCR和Western Blot检测Smad-1，2，3，5，8和a-A、 CTGF、 Collagen I (Coll)、 E-cadherin、ZO-1表达；（3)采取RNAi技术，构建PEA3siRNA，转染体外培养的HK_2细胞从抑制PEA3表达，再加入TGFβ-1刺激，运用Real-time PCR和Western Blot检测PEA3及BMP-7mRNA和蛋白表达、Smad-1,2，3，5，8和a-A、CTGF、Coll、E-cadherin、ZO-1表达；(4)体外培养HK-2细胞，运用TGF-^1刺激检测不同时间点线粒体功能障碍的损伤程度；（5)共转染PEA3和PGC-1α siRNA至HK-2细胞，加入TGFβ-1刺激，运用荧光探针2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸（DCFDA)检测细胞内活性氧(R0S)的变化；JC-1检测线粒体膜电位；Real-timePCR检测线粒体DNA拷贝数；Real-timePCR和Western Blot检测PEA3、PGC1_a、TFAM、E-cadherin、Vimentin、ILK禾口a-A的表达状况。结果（1) Real-time PCR和Western Blot结果显示：PEA3过表达组PEA3mRNA和蛋白表达显著升高，且PEA3过表达可上调BMP-7mRNA和蛋白表达；（2)HK-2细胞加入TGFβ-1刺激后，a-A, CTGF和Coll表达及ad2/3磷酸化明显增多，而E-cadherin和Z0-1表达从及adl/5/8磷酸化降低；PEA3过表达后明显抑制TGFβ-1诱导的a-A, CTGF和Coll表达及ad2/3磷酸化，并上调E-cadherin和Z0-1表达及adl/5/8磷酸化；共转染PEA3和BMP_7siRNA的HK-2细胞加入TGFβ-1刺激，BMP-7siRNA明显降低了PEA3对TGFβ-1的保护意义；(3)HK-2细胞转染PEA3siRNA后，PEA3表达明显下降，其抑制率达50%。PEA3siRNA转染组BMP-7mRNA和蛋白表达均明显降低，该组再加入TGFβ-1刺激，较未加入PEA3siRNA预处理组，a-A、CTGF、Coll、ad2/3磷酸化增多，E-cadherin, ZO-1、adl/5/8磷酸化减少;(4) TGFβ-1可诱导HK-2细胞发生线粒体功能障碍；（5) PEA3过表达可上调PGC-1α和TFAM表达，并缓解TGF-β-1诱导的线粒体功能障碍；转染PGC-1α siRNA后减弱了PEA3对TGF论文导读：加入ATRA刺激后，运用虫荧光素酶活性检测法检测BMP-7启动子的活性，Real-timePCR和WesternBlot检测BMP-7表达，WesternBlot检测Smadl/5/8磷酸化；(4)HK-2细胞转染BMP-7siRNA后再加入ATRA和TGFβ-1处理，运用Real-timePCR和WesternBlot检测E-cadherin、ZO-1、a-A、Coll和CTGFmRNA和蛋白表达;(5)将BMP-7启动子和虫荧光素酶
β-1诱导的线粒体功能障碍和EMT的保护意义。结论PEA3可通过上调BMP-7表达而部分阻断TGFβ-1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化；PEA3可通过上调PGC-1α缓解TGFβ-1诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍进而部分阻断TGF-1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化。第三部分：PEA3在全反式维甲酸阻断肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义目的研究全反式维甲酸对肾小管上皮细胞间充质转分化的影响及机制研宄，并观察PEA3在该历程中发挥的意义。办法（1)体外培养HK-2细胞，运用ATRA预处理30分钟后再加入TGF-旦1刺激48h，运用Real-time PCR禾口Western Blot检测EMT相关分子E_cad-herin、ZO-1、a-A、Coll和CTGFmRNA和蛋白表达;(2)予UUO小鼠ATRA处理，Real-time PCR和Western Blot检测TGF-、E-cadherin、ZO-1、a-A、Coll和CTGF mRNA和蛋白表达；(3)体外培养HK-2细胞，构建BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒，转入HK-2细胞，加入ATRA刺激后，运用虫荧光素酶活性检测法检测BMP-7启动子的活性，Real-time PCR和Western Blot检测BMP-7表达，Western Blot检测Smadl/5/8磷酸化；(4) HK-2细胞转染BMP-7siRNA后再加入ATRA和TGFβ-1处理，运用Real-time PCR和Western Blot检测E-cadherin、ZO-1、a-A、Coll和CTGF mRNA和蛋白表达;(5)将BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒转染至HK-2细胞，分别过表达和干扰RARa和RXRa基因，加入ATRA刺激细胞24h，检测荧光素酶活性；（6)运用Western Blot检测不同剂量ATRA刺激细胞后PEA3的表达变化，如上调，再运用Chip检测ATRA与PEA3的结合状况；将BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒转染至HK-2细胞，分别过表达和干扰PEA3，加入ATRA刺激细胞24h，检测荧光素酶活性；（7)运用Chip检测RARa与PEA3结合状况，分别转染RARa质粒、RXRa质粒、PEA3siRNA后，加入ATRA刺激，检测BMP-7荧光素酶活性。结果（l)ATRA显著呈剂量依赖性地抑制TGFβ-1诱导的EMT，即抑制TGF-β-1诱导的a-A、Coll和CTGF表达而上调E-cadherin和Z0-1表达；（2)Real-time PCR和Western Blot研宄结果表明，UU0小鼠肾组织中TGF-e、a-A,ColI和CTGF表达明显上调，而E-cadherin和Z0_1表达则明显下降，ATRA处理后显著抑制UU0的纤维化；（3) ATRA呈剂量依赖性上调BMP-7启动子活性，推动BMP-7mRNA和蛋白表达，同时我们还发现，ATRA明显推动了Smadl/5/8磷酸化，提示ATRA可活化BMP-7/adl，5，8信号通路。（4) BMP_7siRNA阻断ATRA对EMT的抑制意义，BMP-7siRNA推动了a-A, Coll和CTGF表达而抑制E-cadherin和Z0-1表达。(5)过表达RAR a和RXR a后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性增多，且RARa和RXRa共过表达组，增多最显著，反之，RARa和RXRa干扰后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性降低，且RAR a和RXRa共干扰组，降低最显著；（6)过表达PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性增多，反之，干扰PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性降低；（7)ATRA受体RAR a可与PEA3直接结合，且RAR a、RXR a与PEA3可共同意义于ATRA诱导BMP-7表达的历程。结论体内及体外实验均提示ATRA可从阻断肾小管上皮细胞间充质转分化，且可能通过PEA3/BMP-7/adl，5，8信号途径发挥保护意义。关键词：PEA3论文BMP-7论文PGC-1α论文肾小管上皮细胞间充质转分化论文全反式维甲酸论文
本论文由www.7ctime.com论文导读：摘要5-11Abstract11-18前言18-27第一部分PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达27-45前言27-28材料和办法28-39结果39-43讨论43-45第二部分PEA3在肾小管上皮细胞间充质转分化中的意义及机制研宄45-71前言46-49材料和办法49-56结果56-65讨论65-71第三部分PEA3在全反式维甲酸阻断肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义
,需要可从关系人员哦。摘要5-11
Abstract11-18
前言18-27
第一部分 PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达27-45
前言27-28
材料和办法28-39
结果39-43
讨论43-45
第二部分 PEA3在肾小管上皮细胞间充质转分化中的意义及机制研宄45-71
前言46-49
材料和办法49-56
结果56-65
讨论65-71
第三部分 PEA3在全反式维甲酸阻断肾小管上皮细胞一间充质转分化中的意义71-91
前言72-73
材料和办法73-81
结果81-87
讨论87-91
全文小结91
创新之处及特征91-92
参考文献92-103
英文缩略词103-104
综述104-120
上皮细胞间充质转分化与肾脏纤维化探讨104-112
参考文献108-112
H小管间质损伤与慢性肾脏病的探讨发展112-120
参考文献116-120
附录120-148
致谢148-149