研究抗菌细鳞鱼Cathelicidins鉴定及宿主防御肽CATH_BRALE结构与功能结论

论文导读：精氨酸和4个赖氨酸),静电荷为+13,是一种较强的碱性多肽。其成熟肽有53个氨基酸残基,序列为：RRSKARGGSRGSKMGRKDSKGGSRGRPGSGSRPGGGSSIAGASRGDRGGTRNA。与其他典型的鲑科cathepcidins比对结果表明,鲑科cathepcidins普遍都有着一个包含六个氨基酸(RPGGGS)的重复基元,这表明在遗传的不稳定性方面,其体现出和哺乳动物cathepcidi
摘要：细鳞鱼(Brachymystax lenok),国家二级保护动物,隶属鲑科细鳞属,冷水性鱼类,栖息于山溪水温较低、水质清澈的流水中,我国只有着一种,主要分布于我国的东北和秦岭一带。根据细鳞鱼生活的独特环境和栖息条件,我们预测细鳞鱼体内含有某些特殊的宿主防御基因并能分泌相应的防御性多肽。Cathepcidins,作为宿主防御基因,是动物体内多功能的抗微生物肽家族,目前在几乎所有种类的脊椎动物体内均有发现,其不仅对普通革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌从及病毒具有非常强的抗性,而且对许多临床耐药菌株同样具有较显著的意义。除此之外,cathepcidins还具有趋化免疫细胞、推动伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡等活性。在本次探讨中,我们使用分子生物学技术,提取了细鳞鱼多种重要组织的RNA,构建了相应组织的cDNA文库；并利用半巢式PCR的办法,以脾脏cDNA文库中克隆得到一种新型cathepcidins家族抗微生物肽：CATH_BRALE。 CATH_BRALE的前体包含199个氨基酸,论述等电点(pI)为12.43,论述分子量为5.2006kDa,含有15个碱性氨基酸残基(11个精氨酸和4个赖氨酸),静电荷为+13,是一种较强的碱性多肽。其成熟肽有53个氨基酸残基,序列为：RRSKARGGSRGSKMGRKDSKGGSRGRPGSGS RPGGGSSIAGASRGDRGGTRNA。与其他典型的鲑科cathepcidins比对结果表明,鲑科cathepcidins普遍都有着一个包含六个氨基酸(RPGGGS)的重复基元,这表明在遗传的不稳定性方面,其体现出和哺乳动物cathepcidins一定的相似性。CATH_BRALE在鳃中有最高的表达量,其次是脾脏、肝脏,同源建模显示出的a-hepces和反相平行的β-sheets结构,可把CATH_BRALE归为阳离子的抗菌肽家族。进化分析表明,细鳞鱼CATH_BRALE与大西洋鲑的CATH-2有99%的Bootstrap值。化学合成的CATH_BRALE对检测的40余种菌株具有广谱的杀菌活性,而且对革兰氏阴性菌杀菌能力,CATH_BRALE体现出比人cathepcidin—LL-37更强的活性；CATH_BRALE对铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)最为敏感,最小抑菌浓度仅为1.17μM,对鱼类的两种细菌性病原体杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,最小抑菌浓度(MIC)低至9.38μM。CATH BRALE对人的红细胞只有微小的溶血活性,溶血率仅为6.8%。关键词：cathepcidins论文细鳞鱼论文分子克隆论文组织表达论文抗菌活性论文
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Abstract5-10
引言10-12
1 文献综述12-27

1.1 Cathepcidins抗菌肽的发现及结构特点12-13

1.2 Cathepcidins家族抗菌肽的表达分类极为调控13-14

1.3 Cathepcidins家族抗菌肽的分类14-17

1.4 Cathepcidins的物种的分布17-18

1.5 Cathepcidins抗菌肽家族的抗微生物活性18-20

1.5.1 α-螺旋cathepcidins抗菌活性18-19

1.5.2 β-片层cathepcidins抗菌活性19

1.5.3 伸-螺旋cathepcidins抗菌肽活性19-20

1.5.4 环状cathepcidins抗菌肽活性20

1.6 Cathepcidins的抗菌机制20

1.7 Cathepcidins家族抗菌肽其他生物学功能20-23

1.7.1 抑制组织损伤和NADPH氧化酶活性21

1.7.2 推动组织损伤的修复21

1.7.3 诱导细胞趋化21

1.7.4 推动血管生成21-22

1.7.5 结合内毒素22

1.7.6 细胞溶解活性22

1.7.7 调节适应性免疫22-23

1.7.8 结合自身DNA23

1.8 Cathepcidin抗菌肽的运用及有着不足23-24

1.9 探讨展望24-25

1.10 选题依据和探讨内容25-27

1.10.1论文导读：10.2探讨内容26-272细鳞鱼免疫功能基因Cathepcidins的鉴定27-522.1引言27-282.2实验材料与办法28-402.2.1实验材料28-292.2.2细鳞鱼组织总RNA的提取及脾脏cDNA文库的构建29-322.2.3细鳞鱼脾脏cathepcidins基因的克隆32-372.3.4测序结果分析及细鳞鱼cathepcidins抗菌肽的鉴定372.2.5细鳞鱼cathepcidins前体蛋白序列与
选题依据25-26

1.10.2 探讨内容26-27

2 细鳞鱼免疫功能基因Cathepcidins的鉴定27-52

2.1 引言27-28

2.2 实验材料与办法28-40

2.1 实验材料28-29

2.2 细鳞鱼组织总RNA的提取及脾脏cDNA文库的构建29-32

2.3 细鳞鱼脾脏cathepcidins基因的克隆32-37

2.3.4 测序结果分析及细鳞鱼cathepcidins抗菌肽的鉴定37

2.2.5 细鳞鱼cathepcidins前体蛋白序列与其它代表性物种的cathepcidins的比对37
2.2.6 细鳞鱼cathepcidins前体与代表性鱼类鲑科cathepcindins的氨基酸序列比对37-38

2.7 细鳞鱼cathepcidins同源结构模拟38

2.8 细鳞鱼cathepcidin基因在各组织中的表达差别性38-40

2.9 构建cathepcidins超级蛋白家族成员体系进化树40

2.3 结果与分析40-51

2.3.1 RNA的提取结果及检测40-41

2.3.2 cDNA的提取结果及质量检测41

2.3.3 半巢式PCR结果41-42

2.3.4 菌落PCR鉴定42

2.3.5 CATH_BRALE的鉴定与特点42-45

2.3.6 细鳞鱼cathepcidins与其它代表性cathepcindins的氨基酸序列比对45-46
2.3.7 细鳞鱼cathepcidins与代表性鲑科cathepcindins的氨基酸序列比对46-47

2.3.8 细鳞鱼cathepcidins同源结构模拟分析47-48

2.3.9 细鳞鱼cathepcidins基因在各组织中的表达差别48-49

2.3.10 Cathepcidins超级蛋白家族成员体系进化树分析49-51

2.4 小结51-52

3 细鳞鱼CATH_BRALE抗菌肽的抗菌功能分析52-59

3.1 引言52

3.2 实验材料及办法52-55

3.

2.1 实验材料52-53

3.

2.2 人工合成的抗菌肽的处理53

3.

2.3 抑菌圈分析法检测CATH_BRALE的抑菌活性53-54

3.

2.4 细鳞鱼CATH_BRALE对抑菌圈菌株最小抑菌浓度(MIC)的测定54

3.

2.5 细鳞鱼CATH_BRALE的溶血活性分析54-55

3.3 结果与分析55-58

3.1 CATH_BRALE的抗菌活性筛选55-56

3.2 CATH_BRALE的最小抑菌浓度(MIC)56-58

3.3 CATH_BRALE的溶血活性分析58

3.4 小结58-59

结论59-60
参考文献60-65
攻读硕士学位期间发表学术论文状况65-66
致谢66-67