谈谈降解亚洲玉米螟OfHex2生化性质与生理功能

论文导读：furnacaps(Guenee)为探讨对象,通过基因克隆调取β-N-乙酰己糖胺酶基因《OfHEX2,并在毕赤酵母中重组表达。对其重组蛋白的生化性质、基因的表达方式及基因沉默后的表型进行了研究。综合体外和体内的探讨结果,证明OfHex2的生理功能可能是参与降解溶酶体中糖复合物的降解。本文工作获得如下几方面的结论：

1、序列与体系联系分析

摘要：β-N-乙酰己糖胺酶(EC3.2.1.52)在细菌、真菌和动植物体内广泛有着,以非还原端水解从p-糖苷键连接的乙酰氨基己糖胺基团。昆虫体内有着多种β-N-乙酰己糖胺酶,分别参与几丁质降解、高尔基体糖蛋白N-糖基修饰、溶酶体糖复合物降解及受精历程中的配子识别等多种重要的生理历程。昆虫体内含有多种糖复合物,其降解代谢需要溶酶体β-N-乙酰己糖胺酶的参与,因而可从作为绿色农药设计的潜在靶标。本文从农业害虫亚洲玉米螟Ostrinia furnacaps (Guenee)为探讨对象,通过基因克隆调取β-N-乙酰己糖胺酶基因《OfHEX2,并在毕赤酵母中重组表达。对其重组蛋白的生化性质、基因的表达方式及基因沉默后的表型进行了研究。综合体外和体内的探讨结果,证明OfHex2的生理功能可能是参与降解溶酶体中糖复合物的降解。本文工作获得如下几方面的结论：1、序列与体系联系分析(1)根据已知哺乳动物β-N-乙酰己糖胺酶的保守序列设计特异性引物,以亚洲玉米螟体内调取到编码β---乙酰己糖胺酶的cDNA序列OfHEX2。OfHEX2序列全长1734-bp,包含长度为1674-bp的开放阅读框(ORF),编码一段由557个氨基酸组成的肽链(GenBank登陆号为EF469203)(2) OfHEX2编码产物与20家族β-N-乙酰己糖胺酶成员在TIM桶催化结构域的关键氨基酸残基都高度保守,与人类β-M-乙酰己糖胺酶具有更多的保守结构位点。OfHEX2编码产物在片段Ⅰ(Cys300-Thr315)和片段Ⅱ(Trp435-Trp446)两处具有序列特色。OfHEX2编码产物与脊椎动物β-N-乙酰己糖胺酶的氨基酸序列相似度较高,与具有高度特化底物谱的昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的序列相似度较低。OfHEX2所属分支与昆虫β-N-乙酰己糖胺酶其他三个分支的体系发育联系较远,与哺乳动物β-N-乙酰己糖胺酶距离更近。2、OfHEX2基因的重组表达与纯化(1)构建的表达载体pPIC9-OfHex1和pPIC9-OfHex2,电转化进入毕赤酵母GS115,成功实现OfHex2的高活性分泌表达。优化OfHex1的诱导表达时间为144h,1L培养基上清冲含OfHex2约12.47mg,总活力362.16U,比活力2.06U/mmg。优化OfHex2的诱导表达时间为144h,1L培养基上清冲含OfHex2约1.85mg,总活力16.06U,比活力0.303U/mmg。(2)采取Ni2+金属鳌合亲和层析1L培养基上清纯化获得7.67mg电泳纯OfHex1,总回收率约为61.5%,纯化倍数11.56。1L培养基上清纯化获得1.2mg电泳纯OfHex2,总回收率约为65%,纯化倍数28.72。3、OfHex2的性质表征(1)OfHex2是从同源二聚体的形式有着SDS-PAGE结果显示OfHex2分子量为65kDa, Native-PAGE和凝胶过滤层析结果显示OfHex2的分子量约为134.6kDa。OfHex2的等电点为4.88。(2) OfHex2的最适条件为pH5.5,30℃。酸性的最适pH确保OfHex2能够在溶酶体的酸性环境中高效发挥催化活性。(3) OfHex2对底物的-1位糖环的选择性和空间限制较低,对具有GlcNAc和GalNAc基团的人工单糖苷底物的水解速率相近。但对负电荷底物MU-β-GlcNAc-SO4降解较低,对MU-β-GlcNAc和MU-β-GlcNAc-SO4的水解速率比为250/1。(4) OfHex2可从完全水解双天线N-聚糖链极为天线二糖GlcNAcβ1,2Man。 OfHex2对GnGn的α3分支上的GlcNAc具有偏好性,Vapp,[α3]/Vap.[α6]训为4.97/1,(5) OfHex2对人工单糖苷底物的水解效率最高,对(GlcNAc)2底物亲和力最大,对(GlcNAc)2亲和力最大,Km值为0.169±0.008mM,其亲和方随儿丁寡糖聚合度的增多而降低。儿丁寡糖底物中,OfHex2对儿丁寡糖的降解速率随聚合度的增多呈先升后降的走势,对(GlcNAc)3的降解速率最大,在水解(GlcNAc)6历程中,出现(GlcNAc)2短时积累。OfHex2对二糖GM的亲和力较差，Km值为1.757+0.045mM,Kcat也较低,导致对GM的水解效率论文导读：
最低。(6) OfHex2与人类HsHexB的底物谱相同,能够水解中性的人工单糖苷底物、几丁寡糖、N-聚糖链和糖鞘脂,在已报导的昆虫β-N-乙酰己糖胺酶中具有最广泛的底物谱。OfHex2对底物具有低选择性,能够水解β1,2,β1,3和β1,4糖苷键,对-1与+1位糖配基立体选择性低,证明OfHex2可从胜任昆虫体内的多种中性聚糖的降解。4、OfHEX2的基因表达及基因沉默(1) Real-time PCR结果表明OfHEX2基因的转录水平在蜕皮期明显降低至背景值,在5龄进食期和蛹期高水平表达,进一步探讨发现进食期OfHEX2基因并不在幼虫中肠中农达。推测OfHex2不直接参与表皮和围食膜儿丁质的降解,可能在亚洲玉米螟体内的物质代谢和组织分解与重塑历程中发挥生理意义。(2)5龄早起注射dsOfHEX2实现幼虫体内OfHEX2基因沉默,无致死效果但引起预蛹腹部膨胀从及成虫的附件部位发育畸形,部分具有空囊状蛹翅的蛹因蛹皮失去保护意义而感染病原微生物死亡。推测OfHEX2基因沉默影响了幼虫附件成虫盘的糖复合物的水解代谢,导致附件发育畸形。5、根据OfHex2酶学性质的表征等体外探讨结果和昆虫体内OfHEX2的基因表达方式及基因沉默后的表型,初步证明OfHex2的生理功能是参与昆虫体内溶酶体中糖复合物的降解,不参加昆虫N-糖基修饰,也不直接参加几丁质的水解。关键词：昆虫论文β-N-乙酰己糖胺酶论文几丁质降解论文亚洲玉米螟论文糖复合物降解论文
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Abstract7-13
CONTENTS13-16
图表目录16-18
主要符号表18-19
1 绪论19-40

1.1 背景作用20-35

1.1 β-N-乙酰己糖胺酶概述20

1.2 β-N-乙酰己糖胺酶的分类20-24

1.3 β-N-乙酰己糖胺酶的生理功能24-26

1.4 β-N-乙酰己糖胺酶的催化机制26-27

1.5 20家族β-N-乙酰己糖胺酶的生理底物27-35

1.6 亚洲玉米螟35

1.2 国内外昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的探讨发展35-38

1.3 探讨内容与思路38-40

2 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶基因克隆及转录水平探讨40-61

2.1 引言40

2.2 实验材料与办法40-45

2.1 总RNA的提取40-42

2.2 基因克隆42-44

2.3 序列分析44-45

2.3 实验结果45-57

2.3.1 OfHEX2的基因克隆45-46

2.3.2 OfHEX2编码氨基酸序列分析46-51

2.3.3 OfHEX2体系进化分析51-57

2.4 讨论57-59

2.4.1 OfHEX2编码产物与人类β-N-乙酰己糖胺酶的序列相似性57-58

2.4.2 OfHEX2与其他β-N-乙酰己糖胺酶的特异性序列对比58-59

2.5 小结59-61

3 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的重组表达与纯化61-77

3.1 引言61

3.2 实验材料与办法61-67

3.

2.1 pPIC9表达载体的构建61-63

3.

2.2 毕赤酵母表达菌株的构建63-64

3.

2.3 重组酵母的诱导表达64-65

3.

2.4 培养基上清硫酸铵沉淀65

3.

2.5 金属螯合层析65-66

3.

2.6 蛋白定性、定量与酶活检测办法66-67

3.3 实验结果67-75

3.1 OfHex重组表达菌株的构建67-69

3.2 OfHex在毕赤酵母中的重组表达69-70

3.3 OfHex的分离纯化70-75

3.4 讨论75

3.5 小结75-77

4 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的性质表征77-113

4.1 引言77-78

4.2 实验材料与办法78-84

4.

2.1 分子量和组成模式的测定78-79

4.

2.2 等电点的测定79

4.

2.3 最适pH和温度的测定79

4.

2.4 底物谱测定79-83

4.

2.5 催化动力学测定83-84

4.

2.6 抑制剂探讨84

4.3 实验结果84-108
4.

3.1 OfHex2的分子量和组成模式84-88

4.

3.2 OfHex2的等电点88

4.3.3 OfHex2的最适反应条件88-91论文导读：124-1305.4.1OfHEX2的表达方式124-1255.4.2注射dsRNA介导OfHEX2基因沉默效果分析1255.4.35龄幼虫期OfHEEX2基因沉默由此发育异常的理由分析125-1285.4.4OfHex2的生理功能128-1305.5小结130-1316结论与展望131-134参考文献134-147附录147-149致谢149-150作者介绍150攻读博士学位期间科研项目及科研成果150-152

4.

3.4 OfHex2的底物选择性91-102

4.

3.5 OfHex2的催化动力学探讨102-106

4.

3.6 OfHex2的抑制剂探讨106-108

4.4 讨论108-111

4.1 OfHex2的底物谱108-109

4.2 OfHex2的底物偏好性109-111

4.5 小结111-113

5 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶OfHex2的生理功能探讨113-131

5.1 引言113

5.2 实验材料与办法113-117

5.

2.1 基因转录水平分析113-114

5.

2.2 模板dsDNA的制备114-116

5.

2.3 双链RNA的合成116

5.

2.4 双链RNA的纯化116

5.

2.5 双链RNA的导入116-117

5.

2.6 RNAi样本组成117

5.

2.7 基因沉默效果验117

5.3 结果讨论117-124
5.

3.1 OfHEX2的转录水平分析117-119

5.

3.2 5龄早期RNAi对OfHEX2基因转录水平的影响119-120

5.

3.3 5龄OfHEX2基因沉默对生长发育的影响120-123

5.

3.4 5龄晚期RNAi对OfHEX2基因转录水平影响123-124

5.4 讨论124-130
5.

4.1 OfHEX2的表达方式124-125

5.

4.2 注射dsRNA介导OfHEX2基因沉默效果分析125

5.

4.3 5龄幼虫期OfHEEX2基因沉默由此发育异常的理由分析125-128

5.

4.4 OfHex2的生理功能128-130

5.5 小结130-131
6 结论与展望131-134
参考文献134-147
附录147-149
致谢149-150
作者介绍150
攻读博士学位期间科研项目及科研成果150-152