阐释基质蚕丝人工韧带复合骨髓基质干细胞实验

论文导读：种策略对表面结构进行改性，观察比较不同分组间种子细胞粘附、生长情况，为组织工程化人工韧带支架材料与种子细胞复合提供一种理想的策略。策略蚕丝人工韧带支架材料，采取胰酶、碳酸钠联合脱胶，称重测韧带脱胶率，以EDC（1-乙基-3-(3-二氨丙基)碳二亚胺）/NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）作为交联剂进行胶原的交联，酶标仪法测其交联度
摘要：目的利用自制的蚕丝人工韧带支架，多种策略对表面结构进行改性，观察比较不同分组间种子细胞粘附、生长情况，为组织工程化人工韧带支架材料与种子细胞复合提供一种理想的策略。策略蚕丝人工韧带支架材料，采取胰酶、碳酸钠联合脱胶，称重测韧带脱胶率，以EDC（1-乙基-3-(3-二氨丙基)碳二亚胺）/NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）作为交联剂进行胶原的交联，酶标仪法测其交联度。采取荧光显微镜、扫描电镜观察蚕丝脱胶及与交联胶原复合后的表面结构变化。把韧带支架分为试验组、参照组和空白对照组。参照组蚕丝人工韧带与胶原结合形成蚕丝-胶原结合韧带支架，不做交联处理；试验组采取EDC/NHS对蚕丝-胶原结合韧带支架材料进行交联；空白组未作任何处理。兔的骨髓基质干细胞（Marrowmesenchymal stem cells，MSCs）全血贴壁法培养至第八代，通过CD34、CD44、CD50免疫组化及流式细胞仪进行干细胞检测，调整细胞密度为1×106/L，分别种植于三种支架材料上，对三种材料表面培养的细胞进行了荧光显微镜、扫描电镜及酶标仪的检测。比较不同分组间细胞粘附、增殖生长情况。结果采取胰酶、碳酸钠联合脱胶，能将丝胶基本去除，脱胶率29%左右。当EDC浓度为3g/L时，交联度最大。荧光显微镜下未脱胶蚕丝表面比较完整；脱胶蚕丝结构变得蓬松，表面光滑，丝素纤维暴露。SEM观察，未脱胶蚕丝表面粗糙不平，丝胶包绕在丝素纤维周围；脱胶完全的蚕丝表面很光滑，可见单根的丝素纤维。荧光倒置显微镜及SEM下复合胶原后的韧带可见，胶原呈一薄层分布在韧带表面，呈不规则的线状突起，色泽较白。交联后胶原-蚕丝韧带成蜂窝状。全血贴壁法体外培养的BMSC，检测CD34阴性、CD44、CD50、STRO-1阳性，流式细胞仪检测CD34+细胞占10%左右；CD44+占42%左右，体现为干细胞特性。荧光显微镜下，未交联胶原-蚕丝韧带细胞数目较少，细胞未见舒展；交联后的胶原-蚕丝人工韧带，蚕丝表面粗糙，细胞粘附率较高，舒展充分，蚕丝之间的间隙模糊。SEM下见，交联后的蚕丝人工韧带与细胞贴合紧密，细胞伸展充分，有较多的触角伸出，显著优于其它组。经单因素方差浅析，试验组与参照组、空白对照组比较P＜0.05，差别有统计学作用。结论1.骨髓基质干细胞能够向多种组织细胞分化，在实验中体现出良好的增殖能力，是种子细胞的理想选择。2.胶原蛋白具有良好的生物相容性，是一种良好的蚕丝表面修饰剂。EDC毒性很低，可作为良好的交联剂。3.经过EDC/NHS交联的蚕丝-胶原结合韧带支架材料，能够显著提升细胞黏附率。作用随着人们物质文化水平的不断提升和体育事业的蓬勃进展，韧带损伤病例呈现快速增加的走势。韧带损伤后，往往需要韧带重建手术治疗。目前韧带移植材料有①自体韧带；②异体韧带；③人工韧带，都有着来源少，免疫排斥及传播疾病的缺陷。组织工程人工韧带的进展，为治疗韧带损伤提供了另一条途径。骨髓间充质干细胞能够向多种组织细胞分化，是组织工程人工韧带理想的种子细胞。蚕丝具备良好的生物相容性和细胞亲和力，可作为良好的组织工程支架材料，由于材料表面过于光滑、致密，种子细胞不能与蚕丝韧带复合。本实验通过对蚕丝韧带进行改性，克服了这一难题，为组织工程化人工韧带的进展提供有力的实验支持。关键词：蚕丝人工韧带论文骨髓基质干细胞论文胶原论文
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ABSTRACT6-8
符号说明8-9
前言9-11
第一部分11-22
材料与策略13-17
结果17-18
讨论18-22
第二部分22-37
材料与策略24-28
结果28-31
讨论31-37
结论37-38
附图38-43
参考文献43-47
综述47-54
参考文献51-54
致谢54-55
攻读学位期间发表的学术论文55