阐释基因用于肝纤维化治疗siRNA脂质体递送系统建立及聚乙二醇在肝靶向siRNA脂质体递送系统中影响
最后更新时间：2024-01-19
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论文导读：anti-FVIIsiRNA(?)脂质体递送系统,并对两个系统的体内外效果进行了比较。同时,我们还分别探讨了聚乙二醇(PEG)对乙醇稀释法构建的,anti-hsp47/gp46siRNA脂质体递送系统和anti-FVIIsiRNA脂质体递送系统体内外基因沉默的影响,并对其机理进行了初步探讨。(1)我们用脂膜水化-聚碳酸酯膜挤出法构建了anti-gp46/hsp47siRNA脂质体
摘要：肝纤维化/肝硬化及其并发病严重威胁着人类的健康和生命,对其发病机制的探讨及药物的开发,人们已经投入了大量的人力、财力和物力。小干扰RNAs(siRNAs)已经被证明能够有效地下调人类细胞的基因表达,极具根除人类疾病的潜力。由此,本论文旨在构建针对肝纤维化治疗的anti-hsp47/gp46siRNA脂质体递送系统,以开发针对肝纤维化的siRNA药物为终极目标,对肝纤维化siRNA药物的开发和初步筛选进行了有益的探讨。在此历程中,我们以脂膜水化-聚碳酸酯膜挤压和乙醇稀释两种制剂策略为基础,分别构建了针对肝纤维化的siRNA脂质体递送系统,并进行了优化。针对乙醇逐步稀释法,除了构建针对肝纤维化的anti-hsp47/gp46siRNA脂质体递送系统外,我们还重现了针对心血管疾病以肝实质细胞为靶点的anti-FVII siRNA(?)脂质体递送系统,并对两个系统的体内外效果进行了比较。同时,我们还分别探讨了聚乙二醇(PEG)对乙醇稀释法构建的,anti-hsp47/gp46siRNA脂质体递送系统和anti-FVII siRNA脂质体递送系统体内外基因沉默的影响,并对其机理进行了初步探讨。(1)我们用脂膜水化-聚碳酸酯膜挤出法构建了anti-gp46/hsp47siRNA脂质体递送系统。在无PEG化的系统的考察中,在不同的脂类/siRNA浓度下成功制备了Z-e为217-234纳米,PDI为0.118-0.200,带20-30mV正电荷的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体,此脂质体包封率在90%以上,无显著细胞毒性,但产率很低(siRNA回收率为25-36%),转染效率也极低(20-30%)。在PEG化的系统中,脂类/siRNA浓度对该系统有显著影响,浓度越高,粒径和PDI越小。所得脂质体Z-e为154-169nm,PDI为0.104-0.163,基本呈电中性,siRNA回收率为71-83%。但PEG的加入给该系统带来了细胞毒性,同时屏蔽了基因沉默效率。我们还考察了系统中PEG掺入的影响。PEG掺入比例的增加能显著减小Z-e(213-154nm)和PDI(0.136-0.104),但加入了2-8mole%PEG的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体有一定的毒性,且基本没有基因沉默活性。(2)我们运用乙醇稀释法构建了anti-hsp47/gp46脂质体递送系统,得到了适于本系统的条件,并自行设计组装了以注射器,T接头为(直径=1/16inc)为基础的手动小型装置和以电动泵、T接头为(直径1/16inc)为基础的电动大型装置,为扩大化生产提供了参考数据。我们成功地用乙醇稀释法构建了能顺利进入细胞,在体外低毒有效的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体递送系统(无细胞毒性,蛋白水平基因沉默效率为40-60%以上(54nM),永生化人肝星形细胞gp46mRNA沉默效率为80%),且该脂质体粒径在100nm内,PDI在0.100以下,siRNA回收率达到80%以上,包封率在90%以上,且能在4℃保持一个月稳定。我们还用共聚焦显微镜观察了Cy5标记的siRNA脂质体的体外入胞情况。我们建立了DMN诱导的高gp46基因表达的大鼠快速模型,gp46基因表达可在一周内达到正常大鼠3.5倍左右的。我们所构建的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体递送系统在DMN诱导的高gp46基因表达的大鼠快速模型的体内基因沉默效率为45%左右。(3)我们重现了乙醇稀释法制备的anti-FVII siRNA脂质体递送系统,制备出的包含10mole%PEG-C-DMA的anti-FVII siRNA脂质体及其对照脂质体粒径65-68nm, PDI为0.25左右,呈电中性；siRNA回收率为80%左右,包封率为94%左右。在原代C57BL/6小鼠肝细胞上,该脂质体的FVIImRNA沉默效率为61%(56.6nM)。在小鼠体内动物实验中,测得其对FVⅡ蛋白的抑制率为11%(1mg/kg·bw),38-69%(5mg/kg·bw)和75-88%(10mg/kg·bw)。(4)我们探讨了PEG-C-DMA的摩尔比例对乙醇稀释法制备的siRNA脂质体的物化性质的影响,及对anti-FVII siRNA和anti-hsp47/gp46s论文导读：的小鼠体内FVⅡ基因沉默效率的变化并不是由于含不同PEG-C-DMA摩尔比例的脂质体的入胞情况不同而造成的,拥有高基因沉默效率的含PEG-C-DMA摩尔比例较低的脂质体反而进入小鼠肝实质细胞更少。PEG-C-DMA的摩尔比例较小的siRNA脂质体在pH5.5时具有更好的内含体破坏的能力,可能具有潜在的较好的siRNA释放能力,这可能是造成其在小鼠
iRNA脂质体递送系统的影响。随着PEG-C-DMA摩尔比例的增加,所制备的siRNA脂质体的粒径显著减小,含0.5mole%的脂质体的粒径为129一141nm,含10mole%的脂质体的粒径为65-73nm；所制备的siRNA脂质体的多分散系数(PDI)显著由小变大,以0.05变大至0.25左右；PEG-C-DMA摩尔比例以0.5mole%到5mole%时,siRNA脂质体的siRNA回收率均为80-90%；而当PEG-C-DMA摩尔比例为8-10mole%时,siRNA回收率有小幅跌落,为70-80%,提示过多的PEG-C-DMA会影响了脂质体对siRNA的包封。0.5-10mole%的PEG-C-DMA脂质体的siRNA包封率都在90%左右及以上,说明其能很好的包封保护siRNA。这些脂质体都很好的被PEG-C-DMA所包覆,呈电中性,避开被RES系统捕获。我们确定了当PEG-C-DMA摩尔比例为0.5-10mole%时,以乙醇稀释法制备的siRNA脂质体在一年内均非常稳定。在anti-FVⅡ siRNA脂质体递送系统中,随着PEG-C-DMA摩尔比例的增加,所制备的anti-FVII siRNA脂质体在原代C57BL/6小鼠肝细胞上的体外FVⅡ基因沉默效率显著减小。其中含0.5mole%的脂质体的体外FVⅡ基因沉默效率可达98%(RNA水平),含10mole%的脂质体的体外FVⅡ基因沉默效率为60%(RNA水平)。在小鼠FVII基因沉默实验中也呈现了同样的走势,其中含0.5mole%的脂质体的体内FVII基因沉默效率可达90%(RNA水平),含10mole%的脂质体的体内FVII基因沉默效率仅为20%(RNA水平)。机理探讨提示PEG-C-DMA的摩尔比例不同所造成的小鼠体内FVⅡ基因沉默效率的变化并不是由于含不同PEG-C-DMA摩尔比例的脂质体的入胞情况不同而造成的,拥有高基因沉默效率的含PEG-C-DMA摩尔比例较低的脂质体反而进入小鼠肝实质细胞更少。PEG-C-DMA的摩尔比例较小的siRNA脂质体在pH5.5时具有更好的内含体破坏的能力,可能具有潜在的较好的siRNA释放能力,这可能是造成其在小鼠体内高基因沉默效率的主要理由。在anti-hsp47/gp47siRNA脂质体递送系统中,anti-hsp47/gp47siRNA脂质体中的PEG-C-DMA摩尔比例与体外基因沉默效率成反比。当PEG-C-DMA摩尔比例为0.5mole%给药剂量为54nM时,在Cho-K1-hsp47-dscGFP细胞上基因沉默效率为90%以上；在HT1080-hsp47-dscGFP和hTERT-hsp47-GFP细胞上的基因沉默效率为60%以上；在原代肝星形细胞上,gp46mRNA的沉默效率为97%以上；这些均优于阳性对照。在DMN腹腔注射制备的快速高gp46基因表达大鼠模型中,anti-hsp47/gp47siRNA脂质体中的PEG-C-DMA摩尔比例显著的影响了其体内gp46mRNA沉默效率,但PEG-C-DMA摩尔比例与体外基因沉默效率并不完全成反比。以PBS对照组mRNA表达作为100%,含PEG-C-DMA)摩尔比例为2mole%和5mole%的anti-hsp47/gp47siRNA脂质体的基因沉默效率最高为43%；而摩尔比例为8-10mole%时,基因沉默效率只有14-17%左右。这与体外在肝星形细胞上的结果走势相似。但含PEG-C-DMA摩尔比例为0.5mole%和1mole%的anti-hsp47/gp47siRNA脂质体的基因沉默效率却不是最高,分别为最高为36%和11%。综上,我们已经成功的构建了anti-hsp47/gp47siRNA脂质体递送系统,取得了极好的体外基因沉默效果(95%以上的原代肝星形细胞gp46基因沉默效率),和40-50%的体内基因沉默效果,并对聚乙二醇摩尔比例在其中的的影响进行了探讨,为开发针对肝纤维化的siRNA药物打下了良好的基础。关键词：肝纤维化论文siRNA脂质体肝星形细胞肝实质细胞脂膜-聚碳酸酯膜法乙醇稀释法论文SNALP论文hsp47/gp46基因高gp46基因表达大鼠快速模型FVII基因脂质体小鼠肝细胞中分布内含体破裂论文siRNA释放聚乙二醇论文
本论文导读：验策略131-1333实验结果133-1394讨论139-141第五章siRNA脂质体中聚乙二醇(PEG)所占比重对肝内基因FVⅡ和肝纤维化过表达基因hsp47/gp46表达抑制的影响探讨141-1891材料，仪器及实验试剂141-1442实验策略144-1483实验结果148-1844讨论184-189参考文献189-207革新与不足207-208附录探讨生在读期间的科研成果208-209后记
论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要6-10
ABSTRACT10-14
第一章 文献综述14-45
1 导言14
2 肝纤维化及其基因治疗的探讨进展14-26
3 siRNA递送技术探讨进展26-35
4 siRNA脂质体的制备策略探讨进展35-42
5 本论文的探讨目的和作用42-45
第二章 anti-gp46/hsp47 siRNA脂质体的制备——脂膜水化-聚碳酸酯膜挤出法45-70
1 材料，仪器及实验试剂45-46
2 实验策略46-51
3 实验结果51-68
4 讨论68-70
第三章 乙醇稀释法制备anti-gp46/hsp47 siRNA脂质体及其体内外活性探讨70-129
1 材料，仪器及实验试剂70-72
2 实验策略72-85
3 实验结果85-126
4 讨论126-129
第四章 乙醇稀释法制备anti-FVⅡsiRNA脂质体及其体内外活性探讨129-141
1 材料，仪器及实验试剂129-131
2 实验策略131-133
3 实验结果133-139
4 讨论139-141
第五章 siRNA脂质体中聚乙二醇(PEG)所占比重对肝内基因FVⅡ和肝纤维化过表达基因hsp47/gp46表达抑制的影响探讨141-189
1 材料，仪器及实验试剂141-144
2 实验策略144-148
3 实验结果148-184
4 讨论184-189
参考文献189-207
革新与不足207-208
附录 探讨生在读期间的科研成果208-209
后记209
摘要：肝纤维化/肝硬化及其并发病严重威胁着人类的健康和生命,对其发病机制的探讨及药物的开发,人们已经投入了大量的人力、财力和物力。小干扰RNAs(siRNAs)已经被证明能够有效地下调人类细胞的基因表达,极具根除人类疾病的潜力。由此,本论文旨在构建针对肝纤维化治疗的anti-hsp47/gp46siRNA脂质体递送系统,以开发针对肝纤维化的siRNA药物为终极目标,对肝纤维化siRNA药物的开发和初步筛选进行了有益的探讨。在此历程中,我们以脂膜水化-聚碳酸酯膜挤压和乙醇稀释两种制剂策略为基础,分别构建了针对肝纤维化的siRNA脂质体递送系统,并进行了优化。针对乙醇逐步稀释法,除了构建针对肝纤维化的anti-hsp47/gp46siRNA脂质体递送系统外,我们还重现了针对心血管疾病以肝实质细胞为靶点的anti-FVII siRNA(?)脂质体递送系统,并对两个系统的体内外效果进行了比较。同时,我们还分别探讨了聚乙二醇(PEG)对乙醇稀释法构建的,anti-hsp47/gp46siRNA脂质体递送系统和anti-FVII siRNA脂质体递送系统体内外基因沉默的影响,并对其机理进行了初步探讨。(1)我们用脂膜水化-聚碳酸酯膜挤出法构建了anti-gp46/hsp47siRNA脂质体递送系统。在无PEG化的系统的考察中,在不同的脂类/siRNA浓度下成功制备了Z-e为217-234纳米,PDI为0.118-0.200,带20-30mV正电荷的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体,此脂质体包封率在90%以上,无显著细胞毒性,但产率很低(siRNA回收率为25-36%),转染效率也极低(20-30%)。在PEG化的系统中,脂类/siRNA浓度对该系统有显著影响,浓度越高,粒径和PDI越小。所得脂质体Z-e为154-169nm,PDI为0.104-0.163,基本呈电中性,siRNA回收率为71-83%。但PEG的加入给该系统带来了细胞毒性,同时屏蔽了基因沉默效率。我们还考察了系统中PEG掺入的影响。PEG掺入比例的增加能显著减小Z-e(213-154nm)和PDI(0.136-0.104),但加入了2-8mole%PEG的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体有一定的毒性,且基本没有基因沉默活性。(2)我们运用乙醇稀释法构建了anti-hsp47/gp46脂质体递送系统,得到了适于本系统的条件,并自行设计组装了以注射器,T接头为(直径=1/16inc)为基础的手动小型装置和以电动泵、T接头为(直径1/16inc)为基础的电动大型装置,为扩大化生产提供了参考数据。我们成功地用乙醇稀释法构建了能顺利进入细胞,在体外低毒有效的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体递送系统(无细胞毒性,蛋白水平基因沉默效率为40-60%以上(54nM),永生化人肝星形细胞gp46mRNA沉默效率为80%),且该脂质体粒径在100nm内,PDI在0.100以下,siRNA回收率达到80%以上,包封率在90%以上,且能在4℃保持一个月稳定。我们还用共聚焦显微镜观察了Cy5标记的siRNA脂质体的体外入胞情况。我们建立了DMN诱导的高gp46基因表达的大鼠快速模型,gp46基因表达可在一周内达到正常大鼠3.5倍左右的。我们所构建的anti-gp46/hsp47siRNA脂质体递送系统在DMN诱导的高gp46基因表达的大鼠快速模型的体内基因沉默效率为45%左右。(3)我们重现了乙醇稀释法制备的anti-FVII siRNA脂质体递送系统,制备出的包含10mole%PEG-C-DMA的anti-FVII siRNA脂质体及其对照脂质体粒径65-68nm, PDI为0.25左右,呈电中性；siRNA回收率为80%左右,包封率为94%左右。在原代C57BL/6小鼠肝细胞上,该脂质体的FVIImRNA沉默效率为61%(56.6nM)。在小鼠体内动物实验中,测得其对FVⅡ蛋白的抑制率为11%(1mg/kg·bw),38-69%(5mg/kg·bw)和75-88%(10mg/kg·bw)。(4)我们探讨了PEG-C-DMA的摩尔比例对乙醇稀释法制备的siRNA脂质体的物化性质的影响,及对anti-FVII siRNA和anti-hsp47/gp46s论文导读：的小鼠体内FVⅡ基因沉默效率的变化并不是由于含不同PEG-C-DMA摩尔比例的脂质体的入胞情况不同而造成的,拥有高基因沉默效率的含PEG-C-DMA摩尔比例较低的脂质体反而进入小鼠肝实质细胞更少。PEG-C-DMA的摩尔比例较小的siRNA脂质体在pH5.5时具有更好的内含体破坏的能力,可能具有潜在的较好的siRNA释放能力,这可能是造成其在小鼠
iRNA脂质体递送系统的影响。随着PEG-C-DMA摩尔比例的增加,所制备的siRNA脂质体的粒径显著减小,含0.5mole%的脂质体的粒径为129一141nm,含10mole%的脂质体的粒径为65-73nm；所制备的siRNA脂质体的多分散系数(PDI)显著由小变大,以0.05变大至0.25左右；PEG-C-DMA摩尔比例以0.5mole%到5mole%时,siRNA脂质体的siRNA回收率均为80-90%；而当PEG-C-DMA摩尔比例为8-10mole%时,siRNA回收率有小幅跌落,为70-80%,提示过多的PEG-C-DMA会影响了脂质体对siRNA的包封。0.5-10mole%的PEG-C-DMA脂质体的siRNA包封率都在90%左右及以上,说明其能很好的包封保护siRNA。这些脂质体都很好的被PEG-C-DMA所包覆,呈电中性,避开被RES系统捕获。我们确定了当PEG-C-DMA摩尔比例为0.5-10mole%时,以乙醇稀释法制备的siRNA脂质体在一年内均非常稳定。在anti-FVⅡ siRNA脂质体递送系统中,随着PEG-C-DMA摩尔比例的增加,所制备的anti-FVII siRNA脂质体在原代C57BL/6小鼠肝细胞上的体外FVⅡ基因沉默效率显著减小。其中含0.5mole%的脂质体的体外FVⅡ基因沉默效率可达98%(RNA水平),含10mole%的脂质体的体外FVⅡ基因沉默效率为60%(RNA水平)。在小鼠FVII基因沉默实验中也呈现了同样的走势,其中含0.5mole%的脂质体的体内FVII基因沉默效率可达90%(RNA水平),含10mole%的脂质体的体内FVII基因沉默效率仅为20%(RNA水平)。机理探讨提示PEG-C-DMA的摩尔比例不同所造成的小鼠体内FVⅡ基因沉默效率的变化并不是由于含不同PEG-C-DMA摩尔比例的脂质体的入胞情况不同而造成的,拥有高基因沉默效率的含PEG-C-DMA摩尔比例较低的脂质体反而进入小鼠肝实质细胞更少。PEG-C-DMA的摩尔比例较小的siRNA脂质体在pH5.5时具有更好的内含体破坏的能力,可能具有潜在的较好的siRNA释放能力,这可能是造成其在小鼠体内高基因沉默效率的主要理由。在anti-hsp47/gp47siRNA脂质体递送系统中,anti-hsp47/gp47siRNA脂质体中的PEG-C-DMA摩尔比例与体外基因沉默效率成反比。当PEG-C-DMA摩尔比例为0.5mole%给药剂量为54nM时,在Cho-K1-hsp47-dscGFP细胞上基因沉默效率为90%以上；在HT1080-hsp47-dscGFP和hTERT-hsp47-GFP细胞上的基因沉默效率为60%以上；在原代肝星形细胞上,gp46mRNA的沉默效率为97%以上；这些均优于阳性对照。在DMN腹腔注射制备的快速高gp46基因表达大鼠模型中,anti-hsp47/gp47siRNA脂质体中的PEG-C-DMA摩尔比例显著的影响了其体内gp46mRNA沉默效率,但PEG-C-DMA摩尔比例与体外基因沉默效率并不完全成反比。以PBS对照组mRNA表达作为100%,含PEG-C-DMA)摩尔比例为2mole%和5mole%的anti-hsp47/gp47siRNA脂质体的基因沉默效率最高为43%；而摩尔比例为8-10mole%时,基因沉默效率只有14-17%左右。这与体外在肝星形细胞上的结果走势相似。但含PEG-C-DMA摩尔比例为0.5mole%和1mole%的anti-hsp47/gp47siRNA脂质体的基因沉默效率却不是最高,分别为最高为36%和11%。综上,我们已经成功的构建了anti-hsp47/gp47siRNA脂质体递送系统,取得了极好的体外基因沉默效果(95%以上的原代肝星形细胞gp46基因沉默效率),和40-50%的体内基因沉默效果,并对聚乙二醇摩尔比例在其中的的影响进行了探讨,为开发针对肝纤维化的siRNA药物打下了良好的基础。关键词：肝纤维化论文siRNA脂质体肝星形细胞肝实质细胞脂膜-聚碳酸酯膜法乙醇稀释法论文SNALP论文hsp47/gp46基因高gp46基因表达大鼠快速模型FVII基因脂质体小鼠肝细胞中分布内含体破裂论文siRNA释放聚乙二醇论文
本论文导读：验策略131-1333实验结果133-1394讨论139-141第五章siRNA脂质体中聚乙二醇(PEG)所占比重对肝内基因FVⅡ和肝纤维化过表达基因hsp47/gp46表达抑制的影响探讨141-1891材料，仪器及实验试剂141-1442实验策略144-1483实验结果148-1844讨论184-189参考文献189-207革新与不足207-208附录探讨生在读期间的科研成果208-209后记
论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要6-10
ABSTRACT10-14
第一章 文献综述14-45
1 导言14
2 肝纤维化及其基因治疗的探讨进展14-26
3 siRNA递送技术探讨进展26-35
4 siRNA脂质体的制备策略探讨进展35-42
5 本论文的探讨目的和作用42-45
第二章 anti-gp46/hsp47 siRNA脂质体的制备——脂膜水化-聚碳酸酯膜挤出法45-70
1 材料，仪器及实验试剂45-46
2 实验策略46-51
3 实验结果51-68
4 讨论68-70
第三章 乙醇稀释法制备anti-gp46/hsp47 siRNA脂质体及其体内外活性探讨70-129
1 材料，仪器及实验试剂70-72
2 实验策略72-85
3 实验结果85-126
4 讨论126-129
第四章 乙醇稀释法制备anti-FVⅡsiRNA脂质体及其体内外活性探讨129-141
1 材料，仪器及实验试剂129-131
2 实验策略131-133
3 实验结果133-139
4 讨论139-141
第五章 siRNA脂质体中聚乙二醇(PEG)所占比重对肝内基因FVⅡ和肝纤维化过表达基因hsp47/gp46表达抑制的影响探讨141-189
1 材料，仪器及实验试剂141-144
2 实验策略144-148
3 实验结果148-184
4 讨论184-189
参考文献189-207
革新与不足207-208
附录 探讨生在读期间的科研成果208-209
后记209