结核分枝杆菌Rv3717基因克隆、表达及功能鉴定

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摘要：结核分枝杆菌是全球主要的病原体之一,多重耐药菌株的增加,其威胁性也随之增大。结核分枝杆菌的细胞壁相对较厚、硬并且具有疏水性,地保护细菌,因此抗菌药物的开发具有较高的难度。乙胺丁醇(Ethambutol,EMB),是一种一线抗结核的药物。本课题利用生物信息学的方法,发现一种未知功能的基因Rv3717论文格式要求。当乙胺丁醇作用于结核分枝杆菌后,Rv3717基因的表达上调。该基因被预测具有水解肽聚糖的功能,可能会造成肽聚糖的水解,引起细胞的自溶。肽聚糖是结核分枝杆菌细胞壁核心结构的组成,关于分枝杆菌细胞壁自溶素(也称为肽聚糖水解酶)的了解并不多哲学论文。已知枯草芽孢杆菌的cwlB基因是一种已知的细胞壁自溶素,把此基因的序列与结核分枝杆菌的基因组序列BLAST比对,找到两种同源基因Rv3915和Rv3717,推测该两种基因表达的蛋白质可能同样具有肽聚糖水解酶的活性学士论文。有研究,Rv3915基因被成功克隆表达并且经鉴定具有肽聚糖水解酶的活性。因此,Rv3717基因也有此活性是本课题所要解决的问题。对Rv3717基因肽聚糖水解酶活性的确定,于揭示EMB抗结核的作用机制,并为发现新的药物靶点进而开发新一代抗结核药物理论依据。目的:对Rv3717目的基因的克隆表达,纯化目的蛋白,以对Rv3717基因的功能鉴定。方法:以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,利用PCR技术目的基因的扩增。使用克隆载体pMD18-T与目的基因以“A-T”连接方式构建克隆质粒pMD18-Rv3717;被扩增的目的片段经测序正确后,载体和目的片段分别经双酶切后连接,构建表达质粒硕士论文。利用不同的载体和不同的宿主菌,调节诱导剂的浓度和诱导温度等目的蛋白的优化表达论文格式范例。利用SDS-PAGE和Western blotting检测目的基因的表达,利用Ni~(2+)亲和层析柱对目的蛋白纯化并用酶谱法对目的蛋白功能的检测。结果:构建了克隆质粒pMD18-Rv3717;扩增的目的基因经测序正确后,构建了无突变碱基的表达质粒pET29b-Rv3717和pET16b-Rv3717。表达质粒pET29b-Rv3717在所使用的各种宿主菌中的蛋白表达量极低。表达质粒pET16b-Rv3717在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量高,但是绝大是以包涵体的形式存在,上清液中的可溶性目的蛋白比较少。目的蛋白的上清液经镍柱纯化以后,含有少量杂蛋白的目的蛋白的纯化物。纯化的目的蛋白检测到肽聚糖水解酶的活性。:利用分子克隆技术克隆了结核分枝杆菌的基因Rv3717;使用表达质粒pET16b在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达了目的基因,并且绝大目的蛋白是以包涵体的形式存在。本论文了目的基因Rv3717与肽聚糖水解酶的关系,检测出过表达的目的蛋白的肽聚糖水解酶的活性,但为地探讨两者之间的关系了方法学的借鉴和物质基础毕业论文翻译。关键词：结核分枝杆菌论文乙胺丁醇论文肽聚糖水解酶论文Rv3717论文
摘要6-8
Abstract8-10
前言10-11
11-13
方法13-24
结果24-35
讨论35-39
39-40
参考文献40-43
综述43-52
参考文献49-52
致谢52