浅论酵母Coprinopsiscinerea漆酶基因克隆及其在毕赤酵母中表达

论文导读：
摘要：漆酶(Laccase EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,1883年日本吉田首次在日本漆树的分泌物中发现而得名,之后分别在真菌、细菌、高等植物中都发现了漆酶,但主要有着于植物和真菌中。由于漆酶的作用底物非常广泛,能催化多种酚类化合物和含有苯环的芳香类化合物的氧化,所以漆酶在生物学和环境科学等领域探讨非常活跃。因其较强的氧化还原能力,漆酶在造纸工业、纺织工业、食品工业、生物检测、环境治理等领域具有潜在的运用价值。漆酶广泛的有着于真菌尤其是白腐菌中,本探讨以灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea okayama7#130)为材料,其属于担子菌门,层菌纲,伞菌目,鬼伞科,鬼伞属,也属于白腐真菌类,其含有一个庞大的漆酶家族,共有17种不同的漆酶。本探讨以此菌株中其中一个漆酶基因构建酵母诱导型分泌表达载体,获得高效表达漆酶的毕赤酵母工程菌。本探讨主要的探讨结果如下：1.漆酶基因的选定和克隆灰盖鬼伞菌含有17不同的漆酶基因,本探讨在预实验中设计5个漆酶基因探针引物扩增得到4个漆酶cDNA序列,最后选择了漆酶蛋白氨基酸序列长度适中其含有铜离子结合区的保守序列的漆酶基因1。通过PCR和RT-PCR克隆得到灰盖鬼伞菌漆酶基因1的DNA和cDNA序列,浅析其信号肽序列后又扩增得到不含信号肽序列的漆酶基因clacl。2.毕赤酵母表达载体的构建本探讨构建了毕赤酵母的诱导型分泌表达载体pPIC9K-clac1,所用的漆酶基因1不含信号肽,可在毕赤酵母中实现分泌表达。3.漆酶基因在毕赤酵母GS115中分泌表达及重组酶的酶学性质探讨将构建好的表达载体pPIC9K-clac1通过电击转化毕赤酵母,经筛选转化子得到了数株表达漆酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-clac1,初步表达漆酶活力达到1.108U/mL。通过对工程菌产漆酶的酶学性质的浅析得出：该重组酶最佳反应温度为45℃,最适反应pH值为4.3,热稳定性和pH稳定性均较好。4.对工程菌诱导表达条件的初步优化通过对工程菌GS115-pPIC9K-clac1诱导表达时铜离子、培养基初始pH值、培养温度、接种量和装液量等因素最佳条件的优化,使得工程菌诱导表达漆酶活力提升到1.805U/mL,与没有优化前比较提升62.91%。关键词：漆酶基因论文RT-PCR论文信号肽论文毕赤酵母论文分泌表达论文
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Abstract5-7
第一章 绪论7-15

1.1 本探讨的目的和作用7-8

1.2 漆酶及Coprinopsis cinerea的概述8-9

1.3 漆酶活性的测定及定义9-10

1.4 漆酶基因的克隆10-11

1.5 漆酶基因在毕赤酵母中表达的探讨近况11-13

1.6 漆酶的实际运用近况13-14

1.7 本论文的革新点和探讨内容14-15

第二章 Coprinopsis cinerea的漆酶基因的克隆及序列浅析15-25

2.1 试验材料15

2.2 试验策略15-21

2.3 结果与浅析21-23

2.4 讨论23-25

第三章 漆酶基因的异源表达及酶学性质的探讨25-41

3.1 试验材料25-26

3.2 试验策略26-34

3.3 结果与浅析34-39

3.4 讨论39-41

第四章 重组漆酶诱导表达条件的探讨41-46

4.1 试验材料41

4.2 试验策略41-43

4.3 结果与浅析43-45

4.4 讨论45-46

第五章 结论46-47
附件47-54
参考文献54-57
致谢57-58
个人简历58-59
附录59