试析羧酸苔类植物组织培养及羧酸茋类合成酶基因克隆和功能鉴定研究生

论文导读：PaSTCS1的株系还在进一步的筛选和浅析中。关键词：苔类植物论文组织培养论文化学成分论文羧酸芪类合成酶论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。中文摘要8-10Abstract10-13符号说明13-14第一章文献综述1412下一页
摘要：苔藓植物是介于藻类和蕨类植物之间的一个非常重要的植物类群,目前已发现的苔藓植物约有23000种,其中苔纲(Hepaticae)6000余种,藓纲(Musci)约14000种,角苔纲(Anthocerotae)300种左右。苔类植物中的化合物种类繁多结构多样,其中富含的萜类和酚类化合物具有多种多样的生物活性,如抗真菌、抗肿瘤、昆虫拒食、自由基清除等,由此苔类植物是生物活性天然产物的宝库。但是由于苔类植物生长环境特殊、个体矮小且往往种间杂生,所以很难富集到大量的高纯度的材料进行探讨。现代生物学技术为解决这类困难提供了新的思路。组织培养技术是解决苔类植物来源不足的一个行之有效的策略。通过在无菌条件下诱导苔类植物的愈伤组织,制约其生长条件,达到快速生产单一种类苔藓材料的效果。本论文选取了粗裂地钱(Marchantia paleacea Bertol.)孢蒴为外植体,表面消毒后置于MS培养基上诱导愈伤。所诱导的愈伤生长迅速,继代两周后愈伤的生物量可以达到初始生物量的15倍左右。对诱导的愈伤组织进行化学成分探讨,共分离得到11个化合物：β-sitosterol1, Daucosterine2, Dibutyl phthalate3, Pubinernoid A4, Machantin C5, Neomarchantin A6, Lunularin7, Riccardin C8, Perrottetin E9, Apigenin10, Lunularic acid11。化合物结构采取ESI-MS,1H NMR,13C NMR,2D NMR等波谱学策略及参考已知化合物的波谱数据鉴定。并初步探究了分离得到的六种联苄类化合物对拟南芥的化感作用,结果显示联苄类化合物对拟南芥根的生长具有抑制作用,并且呈现出浓度依赖性。另外,对于天然活性产物生物合成途径的探讨也是至关重要的。通过代谢工程的手段将联苄类化合物生物合成途径中的关键酶基因构建到工程菌中进行表达,通过体外或体内的酶促反应生成目标化合物或提升天然活性产物的含量也是解决活性化合物来源的一个途径。本论文构建了钝鳞紫背苔(Plagiochaa appendiculatum)的cDNA文库,以中得到一个注释为羧酸茋类合成酶(stilbenecarboxylate synthase, STCS)基因的序列,另外根据文献报道的地钱的羧酸茋类合成酶序列信息,以钝鳞紫背苔和地钱中克隆得到两类羧酸茋类合成酶基因,分别为STCS1和STCS2。构建它们的原核表达载体并且转入表达型大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白的诱导表达。纯化后的蛋白进行体外酶活鉴定,结果显不STCS2可以以对羟基香豆酰辅酶A (p-coumaroyl-CoA)为底物生成柚皮素,也可以接受二氢对羟基香豆酰辅酶A (dihydro-p-coumaroyl-CoA)为底物生成5-hydroxylunularic acid, dihydro-4-coumaroyltriacetic acid lactone (dihydro-CTAL), dihydrobisnoryangoni (dihydro-BNY),为双功能酶。而STCS1虽然也可以接受二氢对羟基香豆酰辅酶A为底物生成上面陈述的三种产物,却不能催化对羟基香豆酰辅酶A生成柚皮素,即STCS1不具有查尔酮合成酶功能,与文献报道一致。将PaSTCS2和PaSTCS1构建到植物表达载体上,转入农杆菌,通过农杆菌介导的遗传转化法转化粗裂地钱的愈伤组织及拟南芥tt4突变体。筛选出的阳性株系进行基因表达水平及化学成分浅析。过量表达PaSTCS2和PaSTCS1的粗裂地钱的愈伤组织半月苔酸含量提升,再次证明该酶与苔类植物单联苄类化合物的生成相关。过量表达PaSTCS2的拟南芥株系的种皮颜色得到回补,呈浅棕色。转PaSTCS1的株系还在进一步的筛选和浅析中。关键词：苔类植物论文组织培养论文化学成分论文羧酸芪类合成酶论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。中文摘要8-10
Abstract10-13
符号说明13-14
第一章 文献综述14论文导读：
-36
1 苔类植物活性成分14-18

1.1 抗菌活性14-15

1.2 抗肿瘤活性15-16

1.3 昆虫拒食及杀虫活性16-17

1.4 其它生物活性17-18

2 苔类植物组织培养18-25

2.1 生产次级代谢产物19-20

2.2 外源底物的生物转化20-21

2.3 基因功能验证21-22

2.4 次级代谢产物生物合成途径的探讨22-25

3 植物Ⅲ型聚酮合酶家族25-29

3.1 查尔酮合成酶(CHS)25-28

3.2 芪类合成酶(STS)28-29

3.3 羧酸芪类合成酶(STCS)29

4 结论29-30
参考文献30-36
第二章 粗裂地钱的组织培养及其愈伤组织的化学成分探讨36-55
1 前言36-37
2 实验材料37-39

2.1 植物材料37

2.2 主要仪器37

2.3 主要培养基37-39

2.4 试剂及层析系统39

3 实验策略39-42

3.1 粗裂地钱的组织培养39-40

3.2 粗裂地钱愈伤组织的提取分离40-41

3.3 联苄类化合的化感作用探讨41-42

4 实验结果42-52

4.1 愈伤组织的诱导42-43

4.2 化合物结构鉴定及波谱数据43-51

4.3 联苄类化合物化感作用51-52

5 总结52
参考文献52-55
第三章 苔类植物羧酸芪类合成酶(STCS)的克隆和功能鉴定55-99
1 前言55
2 实验材料55-59

2.1 植物材料55

2.2 菌株与质粒55-56

2.3 主要试剂和试剂盒56-57

2.4 主要溶液和培养基57-58

2.5 实验仪器和设备58

2.6 PCR引物序列58-59

3 实验策略59-76

3.1 钝鳞紫背苔cDNA文库的构建59

3.2 PCR获取目的片段59-62

3.3 原核表达载体构建62-67

3.4 蛋白表达67-69

3.5 体外酶活功能鉴定69-70

3.6 植物表达载体构建及转化农杆菌70-72

3.7 目的基因在愈伤组织的过表达72-75

3.8 目的基因在拟南芥中的过表达75-76

4 实验结果76-95

4.1 PaSTCS1和PaSTCS2的克隆和序列浅析76-84

4.2 原核表达载体构建84

4.3 蛋白表达84-86

4.4 体外酶活结果86-89

4.5 PaSCTCS1和PaSTCS2转化愈伤组织89-93

4.6 PaSTCS2转化拟南芥93-95

5 总结95-96
参考文献96-99
致谢99-100
攻读学位期间发表的学术论文目录100-101
附录 化合物图谱101-110
学位论文评阅及答辩情况表110