浅析定量荧光定量PCR快速检测登革1型病毒要求
最后更新时间：2024-03-31
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论文导读：着关键的作用：①在20世纪90年代早期,TaqDNA多聚酶的5,核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光标记探针,由此使得间接地检测PCR产物成为可能。②此后荧光双标记探针的运用使得在一个密闭的反应管中实时地监测反应全历程成为可能。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化进展导致实时荧光定量PCR技术在探讨工作中的广
摘要：一、探讨背景和目的登革病毒(dengue virus, DEN)属黄病毒科黄病毒属,为单股正链RNA病毒,体积较小,约45-55nm,依抗原性不同分为四个血清型[1,2]。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播,引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒病流行于热带和亚热带地区,每年约有5000万至1亿人感染,是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病,已成为全球公共卫生关注的焦点之一[3]。登革热的诊断目前主要依赖病毒分离培养以及血清中特异性IgM、IgG抗体测定,血清学诊断由于登革抗体与其他黄病毒有着交叉反应,故有着一定的局限性[4]；病毒的分离鉴定,由于费时费力,技术要求高,不适合临床利用。分子生物学检测技术的进展,为登革热的早期诊断提供了可能,运用普通RT-PCR策略可在1天内进行登革病毒的鉴定和分型诊断,但该策略易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果。TaqMan实时荧光定量PCR技术,相对于常规的PCR技术而言,具有更高的敏感性、特异性和重复性。而且还具有快速、高通量、污染少等特点。本探讨欲建立更省时、特异,可对登革1型病毒进行早期诊断的实时荧光定量PCR策略。随着分子生物学技术的飞速进展,实时荧光定量PCR技术在生物学探讨中的运用越来越广泛。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应系统中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量浅析的策略。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号,以而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是将荧光共振能量传递技术运用于常规PCR中,在探针的5,端标记一个荧光报告基团(R),3,端标记一个淬灭基团(Q),两者可构成能量传递结构,即5,端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制；当两者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强,荧光监测系统可接收到荧光信号。利用以上荧光产生原理,在PCR历程中可以连续不断地检测反应系统中荧光信号的变化。当信号增强到某一域值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,域值的缺省设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,Ct值被记录下来。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在这一技术的进展历程中,两个重要的发现起着关键的作用[5]：①在20世纪90年代早期,TaqDNA多聚酶的5,核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光标记探针,由此使得间接地检测PCR产物成为可能。②此后荧光双标记探针的运用使得在一个密闭的反应管中实时地监测反应全历程成为可能。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化进展导致实时荧光定量PCR技术在探讨工作中的广泛运用。1996年,美国运用生物系统公司(ApppedBiosystems, ABI)的ABIPri7700和5700、罗氏公司(Roehe)的LightCyclerTM等仪器率先投入商业利用。它们的扩增和检测全部自动化、耗时短、工作效率高。国内利用较多的有ABI Pri7000、7900、7700型和LightCylerTM等。ABIPri7900等RQ-PCR仪可用于高通量(384孔板)检测,而ABIPriSm7000则利用了多色多通道技术。目前最常用的实时荧光定量PCR产物的检测技术都是运用荧光染料或基团,并将PCR与实时信号检测相结合,其中最简单的是双链DNA嵌合荧光染料技术,该法成本低廉,但SYBRGreen荧光染料能与所有的DNA双链相结合,特异性不如TaqMan探针法。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。而TaqMan探针法则是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3,-5,外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。随着探讨的深入及试剂的商品化,又进展衍生出更多的荧光定量PCR检测技术,如TaqMan MGB法、Molecular Beacon法、Amppsensor、Light c论文导读：且根据Ct值对荧光定量PCR策略以及常规PCR策略进行比较。三、探讨结果1、标准曲线建立：得到标准曲线相联系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,回归方程Y=-3.410logX+34.87(Y为Ct值,X为模板浓度),并且对Ct值和模板浓度的对数值进行相关与回归浅析,直线相联系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.410,P=0.000,以中可以看出,所作的标准曲
ycler、complex probes等。二、探讨策略1、引物探针设计及标准曲线建立：以GenBank中下载八十株不同年份和不同地区的登革1型病毒基因组全序列,登革2、3、4型病毒以及黄病毒属其它病毒也各下载十株,寻找保守序列,利用BeaconDesigner7.0软件设计引物探针。将含有保守序列的质粒经过10倍系列稀释后,进行荧光定量PCR反应得到相应的扩增曲线和标准曲线。2、荧光定量PCR特异性、重复性、再现性、敏感性实验：用建立的荧光定量PCR策略对登革1-4型病毒标准株以及乙型脑炎减毒活疫苗株进行检测。线性化后的质粒10倍倍比稀释6个浓度,以1.01×107稀释到1.01×102copies/μl,分不同的时间重复三次,每次做三个重复孔,验证重复性和再现性。此外,对PMDns2a质粒进行10倍倍比稀释,荧光定量PCR检测比较其敏感性,将扩增片段反转录为RNA,进行倍比稀释做敏感性检测。3、临床标本检测：对广州市第八人民医院提供的cDNA,以及对东莞疑似病人血清提取RNA并反转录的cDNA,进行荧光定量PCR检测,用登革病毒总引物探针进行验证,并且根据Ct值对荧光定量PCR策略以及常规PCR策略进行比较。三、探讨结果1、标准曲线建立：得到标准曲线相联系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,回归方程Y=-3.410logX+34.87(Y为Ct值,X为模板浓度),并且对Ct值和模板浓度的对数值进行相关与回归浅析,直线相联系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.410,P=0.000,以中可以看出,所作的标准曲线的Ct值与初始浓度有较好的线性联系。2、特异性：采取本策略对登革1型病毒提取核酸的扩增结果为阳性,而对其它三型登革病毒以及乙型脑炎病毒提取核酸的扩增结果均显示为阴性,表明所建立的针对登革1型病毒的荧光定量PCR策略不会受到其它三型登革病毒以及乙型脑炎病毒干扰。3、重复性和再现性：重复性标准差(SDr)在0.04与0.44之间,再现性标准差(SDR)在0.14与0.29之间,变异系数2%,并且通过析因方差浅析得浓度和时间之间不有着交互效应(F=0.691,P=0.726),不同稀释浓度之间的Ct值有差别(F=10528.497,P=0.000)；三个重复时间之间并无差别(F=0.451,P=0.641)。说明建立的策略具有良好的重复性和再现性。4、敏感性：用本探讨建立的荧光定量PCR策略检测质粒,敏感性可达到1copy/μl。用RNA进行敏感性检测,可达102copies/μl。并且对Ct值和RNA浓度的对数值进行相关与回归浅析,直线相联系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.305,P=0.000,认为Ct值与RNA浓度的对数值直接有着直线回归联系,得回归方程Y=-3.3051ogX+39.727(Y为Ct值,X为RNA浓度)。5、临床标本检测：对广州市第八人民医院提供的cDNA样本以及东莞疑似病人血清进行检测。采取本探讨所建立的登革1型病毒型特异引物探针进行荧光定量PCR检测,对本策略以及常规PCR策略进行配对计数资料的卡方检验(χ2检验),P=0.000,表明两种检测策略有统计学差别,而本探讨策略阳性率显著高于常规PCR策略,表明本探讨策略优于常规PCR。四、结论本探讨成功设计了针对登革1型病毒的型特异性引物和探针,可实现对临床疑似病例的早期快速检测和鉴别诊断,具有快速、敏感、特异、重复性好的特点,并可对标本中病毒进行定量。关键词：登革病毒论文实时荧光定量PCR论文检测和鉴定论文常规PCR论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-7
ABSTRACT7-14
前言14-19
第一章 引物探针设计及标准曲线建立19-30
1 材料19-20
2 策略20-22
3 结果22-28
4 讨论28-29
5 小结29-30
第二章 特异性、重复性、再现性和敏感性验证30-51
1 材料30
2 策略30-38
3 结果38-49
4 讨论49-50
5 小结50-51
第三章 临床样品检测51-57
1 材料51
2 策略51-52
3 结果论文导读：52-544讨论54-565小结56-57参考文献57-60附录60-76英文缩略词表76-77硕士期间成果77-78致谢78-80统计合格证明80上一页123
52-54
4 讨论54-56
5 小结56-57
参考文献57-60
附录60-76
英文缩略词表76-77
硕士期间成果77-78
致谢78-80
统计合格证明80
摘要：一、探讨背景和目的登革病毒(dengue virus, DEN)属黄病毒科黄病毒属,为单股正链RNA病毒,体积较小,约45-55nm,依抗原性不同分为四个血清型[1,2]。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播,引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒病流行于热带和亚热带地区,每年约有5000万至1亿人感染,是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病,已成为全球公共卫生关注的焦点之一[3]。登革热的诊断目前主要依赖病毒分离培养以及血清中特异性IgM、IgG抗体测定,血清学诊断由于登革抗体与其他黄病毒有着交叉反应,故有着一定的局限性[4]；病毒的分离鉴定,由于费时费力,技术要求高,不适合临床利用。分子生物学检测技术的进展,为登革热的早期诊断提供了可能,运用普通RT-PCR策略可在1天内进行登革病毒的鉴定和分型诊断,但该策略易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果。TaqMan实时荧光定量PCR技术,相对于常规的PCR技术而言,具有更高的敏感性、特异性和重复性。而且还具有快速、高通量、污染少等特点。本探讨欲建立更省时、特异,可对登革1型病毒进行早期诊断的实时荧光定量PCR策略。随着分子生物学技术的飞速进展,实时荧光定量PCR技术在生物学探讨中的运用越来越广泛。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应系统中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量浅析的策略。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号,以而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是将荧光共振能量传递技术运用于常规PCR中,在探针的5,端标记一个荧光报告基团(R),3,端标记一个淬灭基团(Q),两者可构成能量传递结构,即5,端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制；当两者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强,荧光监测系统可接收到荧光信号。利用以上荧光产生原理,在PCR历程中可以连续不断地检测反应系统中荧光信号的变化。当信号增强到某一域值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,域值的缺省设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,Ct值被记录下来。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在这一技术的进展历程中,两个重要的发现起着关键的作用[5]：①在20世纪90年代早期,TaqDNA多聚酶的5,核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光标记探针,由此使得间接地检测PCR产物成为可能。②此后荧光双标记探针的运用使得在一个密闭的反应管中实时地监测反应全历程成为可能。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化进展导致实时荧光定量PCR技术在探讨工作中的广泛运用。1996年,美国运用生物系统公司(ApppedBiosystems, ABI)的ABIPri7700和5700、罗氏公司(Roehe)的LightCyclerTM等仪器率先投入商业利用。它们的扩增和检测全部自动化、耗时短、工作效率高。国内利用较多的有ABI Pri7000、7900、7700型和LightCylerTM等。ABIPri7900等RQ-PCR仪可用于高通量(384孔板)检测,而ABIPriSm7000则利用了多色多通道技术。目前最常用的实时荧光定量PCR产物的检测技术都是运用荧光染料或基团,并将PCR与实时信号检测相结合,其中最简单的是双链DNA嵌合荧光染料技术,该法成本低廉,但SYBRGreen荧光染料能与所有的DNA双链相结合,特异性不如TaqMan探针法。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。而TaqMan探针法则是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3,-5,外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。随着探讨的深入及试剂的商品化,又进展衍生出更多的荧光定量PCR检测技术,如TaqMan MGB法、Molecular Beacon法、Amppsensor、Light c论文导读：且根据Ct值对荧光定量PCR策略以及常规PCR策略进行比较。三、探讨结果1、标准曲线建立：得到标准曲线相联系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,回归方程Y=-3.410logX+34.87(Y为Ct值,X为模板浓度),并且对Ct值和模板浓度的对数值进行相关与回归浅析,直线相联系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.410,P=0.000,以中可以看出,所作的标准曲
ycler、complex probes等。二、探讨策略1、引物探针设计及标准曲线建立：以GenBank中下载八十株不同年份和不同地区的登革1型病毒基因组全序列,登革2、3、4型病毒以及黄病毒属其它病毒也各下载十株,寻找保守序列,利用BeaconDesigner7.0软件设计引物探针。将含有保守序列的质粒经过10倍系列稀释后,进行荧光定量PCR反应得到相应的扩增曲线和标准曲线。2、荧光定量PCR特异性、重复性、再现性、敏感性实验：用建立的荧光定量PCR策略对登革1-4型病毒标准株以及乙型脑炎减毒活疫苗株进行检测。线性化后的质粒10倍倍比稀释6个浓度,以1.01×107稀释到1.01×102copies/μl,分不同的时间重复三次,每次做三个重复孔,验证重复性和再现性。此外,对PMDns2a质粒进行10倍倍比稀释,荧光定量PCR检测比较其敏感性,将扩增片段反转录为RNA,进行倍比稀释做敏感性检测。3、临床标本检测：对广州市第八人民医院提供的cDNA,以及对东莞疑似病人血清提取RNA并反转录的cDNA,进行荧光定量PCR检测,用登革病毒总引物探针进行验证,并且根据Ct值对荧光定量PCR策略以及常规PCR策略进行比较。三、探讨结果1、标准曲线建立：得到标准曲线相联系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,回归方程Y=-3.410logX+34.87(Y为Ct值,X为模板浓度),并且对Ct值和模板浓度的对数值进行相关与回归浅析,直线相联系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.410,P=0.000,以中可以看出,所作的标准曲线的Ct值与初始浓度有较好的线性联系。2、特异性：采取本策略对登革1型病毒提取核酸的扩增结果为阳性,而对其它三型登革病毒以及乙型脑炎病毒提取核酸的扩增结果均显示为阴性,表明所建立的针对登革1型病毒的荧光定量PCR策略不会受到其它三型登革病毒以及乙型脑炎病毒干扰。3、重复性和再现性：重复性标准差(SDr)在0.04与0.44之间,再现性标准差(SDR)在0.14与0.29之间,变异系数2%,并且通过析因方差浅析得浓度和时间之间不有着交互效应(F=0.691,P=0.726),不同稀释浓度之间的Ct值有差别(F=10528.497,P=0.000)；三个重复时间之间并无差别(F=0.451,P=0.641)。说明建立的策略具有良好的重复性和再现性。4、敏感性：用本探讨建立的荧光定量PCR策略检测质粒,敏感性可达到1copy/μl。用RNA进行敏感性检测,可达102copies/μl。并且对Ct值和RNA浓度的对数值进行相关与回归浅析,直线相联系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.305,P=0.000,认为Ct值与RNA浓度的对数值直接有着直线回归联系,得回归方程Y=-3.3051ogX+39.727(Y为Ct值,X为RNA浓度)。5、临床标本检测：对广州市第八人民医院提供的cDNA样本以及东莞疑似病人血清进行检测。采取本探讨所建立的登革1型病毒型特异引物探针进行荧光定量PCR检测,对本策略以及常规PCR策略进行配对计数资料的卡方检验(χ2检验),P=0.000,表明两种检测策略有统计学差别,而本探讨策略阳性率显著高于常规PCR策略,表明本探讨策略优于常规PCR。四、结论本探讨成功设计了针对登革1型病毒的型特异性引物和探针,可实现对临床疑似病例的早期快速检测和鉴别诊断,具有快速、敏感、特异、重复性好的特点,并可对标本中病毒进行定量。关键词：登革病毒论文实时荧光定量PCR论文检测和鉴定论文常规PCR论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-7
ABSTRACT7-14
前言14-19
第一章 引物探针设计及标准曲线建立19-30
1 材料19-20
2 策略20-22
3 结果22-28
4 讨论28-29
5 小结29-30
第二章 特异性、重复性、再现性和敏感性验证30-51
1 材料30
2 策略30-38
3 结果38-49
4 讨论49-50
5 小结50-51
第三章 临床样品检测51-57
1 材料51
2 策略51-52
3 结果论文导读：52-544讨论54-565小结56-57参考文献57-60附录60-76英文缩略词表76-77硕士期间成果77-78致谢78-80统计合格证明80上一页123
52-54
4 讨论54-56
5 小结56-57
参考文献57-60
附录60-76
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硕士期间成果77-78
致谢78-80
统计合格证明80