简论分子BAFF与TACI相互作用功能结构域及关键氨基酸
最后更新时间：2024-04-17
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论文导读：通过计算机模拟的方式浅析TACI与BAFF的结合方式以及BAFF被TACI识别的关键区域。利用分子生物学突变实验以及功能评价策略对论述预测的抗原表位进行实验验证。具体工作如下：一、通过分子生物学、免疫学等策略完成人BAFF蛋白胞外段的表达纯化及活性鉴定。(1)将实验室保存的pET32a(+)/BAFF、pET32a(+)/TACI质粒进行原核表达、通
摘要：B细胞激活因子(B cell activating factor, BAFF)是1999年发现的TNF超家族成员之一,它可特异性的刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体,对B细胞的存活和发育起到重要的调控作用。BAFF-R(BR3)、TACI、BCMA分别是BAFF的三个受体,它们分布在B细胞分化发育的不同时期,BAFF正是通过这些受体在B细胞分化发育的各个阶段及免疫调节中发挥的作用。探讨表明：BAFF缺乏会导致外周B细胞成熟缺陷和降低免疫球蛋白的水平；而BAFF过表达则会破坏免疫耐受,与许多自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE), sjogren氏综合症,类风湿关节炎(RA)的发生、进展密切相关。由此,BAFF及其受体作为治疗自身免疫疾病的特异性靶标,受到广泛的关注。受体TACI与BAFF具有高亲和力,它可以特异性识别BAFF并与之结合。由此,可溶性受体融合蛋白(TACI-Fc)可作为BAFF抑制剂治疗自身免疫疾病,目前该抑制剂已经进入临床试验阶段并取得初步成效。同时,新型拮抗剂开发已成为目前的探讨热点。然而,BAFF是如何识别TACI发挥功能尚不十分清楚,确定BAFF与TACI相互作用的关键功能位点对于研制新型拮抗剂具有重要的指导作用。本探讨基于配体(BAFF)和受体(TACI)晶体结构以及论述模拟获得的三维构象,借助计算机辅助分子对接技术、动力学模拟技术构建配体-受体相互作用的复合物模型,通过计算机模拟的方式浅析TACI与BAFF的结合方式以及BAFF被TACI识别的关键区域。利用分子生物学突变实验以及功能评价策略对论述预测的抗原表位进行实验验证。具体工作如下：一、通过分子生物学、免疫学等策略完成人BAFF蛋白胞外段的表达纯化及活性鉴定。(1)将实验室保存的pET32a(+)/BAFF、pET32a(+)/TACI质粒进行原核表达、通过融合蛋白上携带的His标签进行镍离子亲和纯化,将获得的蛋白(rhBAFF、rhTACI)通过SDS-PAGE及Western Blot完成特异性鉴定；(2)通过非还原电泳、Western Blot、HPLC对rhBAFF在PBS缓冲液中的有着形式做了浅析；(3)用ELISA策略检测了rhBAFF与rhTACI的结合活性,并与商品化蛋白进行了比较；(4)通过小鼠B细胞增殖实验在体外验证了rhBAFF的功能活性；二、借助计算机模拟的策略、通过生物学实验验证确定rhBAFF与TACI相互作用的重要区域。(1)借助BAFF以及受体TACI晶体结构,选择合适的力场参数,在考虑溶剂效应的情况下,利用计算机辅助分子对接技术经动力学模拟构建BAFF与受体相互作用空间构象；(2)利用分子生物学策略构建rhBAFF区域突变体的原核表达载体,在体外表达纯化及鉴定并通过非还原电泳和HPLC的策略鉴定三聚体结构；(3)通过ELISA及Octet蛋白相互作用动力学浅析比较rhBAFF、rhBAFF区域突变体与TACI的结合能力的差别；(4)通过小鼠B细胞增殖实验以及经典NF-κB的激活实验在体外评判rhBAFF与突变体功能活性的差别,确定TACI识别BAFF的功能域；三、在确定rhBAFF功能域的基础上进一步对功能域中每个氨基酸位点进行论述模拟,选择关键位点进行探讨,经实验评价确定了rhBAFF与TACI相互作用功能域的重要位点。(1)利用获得的TACI与BAFF作用复合物空间结构,通过计算机辅助虚拟突变技术对203～211、233～238结构域进行逐点虚拟扫描突变,通过相互作用能量的变化进而预测TACI识别BAFF的关键位点。(2)利用分子生物学策略构建rhBAFF单点突变体的原核表达载体,完成突变体的表达纯化及鉴定；(3)通过ELISA及Octet蛋白相互作用动力学浅析比较rhBAFF、rhBAFF单点突变体与TACI的结合能力的差别；(4)通过小鼠B细胞增殖实验以及经典NF-KB的激活实验在体外评判rhBAFF与单点突变体的功能活性差别确定TACI识别BAFF的关键功能位点；具体结果如下：一、获得了高纯度有活性的人BAFF胞外段及受体TACI胞外段的重组融合蛋白(1)经原核表达、亲和纯化,获得rhBAFF、rhTACI的可溶表达蛋白,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,所表达蛋白的纯度高、特异性强；(2)论文导读：关键位点的验证及功能评价70-76总结76-77参考文献77-81综述81-90参考文献87-90个人简历90攻读硕士学位期间取得成果90-91致谢91-92上一页12
经非还原电泳、Western Blot、HPLC浅析rhBAFF在PBS缓冲液中的确为三聚体形式有着且纯度超过90%；(3)用ELISA双夹心法证实rhBAFF能够特异性的结合rhTACI,与商品化蛋白相比无显著差别；(4)通过小鼠B细胞增殖实验在体外验证了rhBAFF的促增殖活性；二、明确了BAFF与TACI相互作用的关键功能区域(1)利用获得的BAFF与受体作用复合物空间构象,通过分子间氢键形成论述、距离几何学以及计算机图形学技术以论述上合理判别BAFF受体TACI识别BAFF的功能位点；在合理考虑BAFF二级结构以及分子内氢键的条件下,通过计算机辅助分子模拟合理设计BAFF的五个区域突变体；(2)构建了rhBAFF(突变体)／pET32a(+)的原核表达载体；成功表达rhBAFF的片段突变体：M1(158-165)、M2(203-211)、M3(225-231)M4(233-238)、M5(264-269),并通过镍离子亲和介质纯化得到高纯度的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确,Western印迹和HPLC的结果证实在非还原条件下突变体的分子量约为110bp,均为三聚体形式；(3) ELISA与蛋白相互作用动力学浅析结果表明突变体M2、M4、M5的结合TACI的能力显著降低。小鼠B淋巴细胞增殖试验和经典NF-κB激活实验结果显示,突变体M2、M4与rhBAFF相比的生物学活性显著降低,初步确定rhBAFF的突变体M2、M4突变的区域203-211,233-238为BAFF的功能区域；三、明确了rhBAFF与TACI相互作用功能域的关键位点(1)通过虚拟单点突变对BAFF与TACI相互识别的关键位置(M2、M4)进行论述预测,经相互作用能的变化动态浅析了单点突变对BAFF构象以及BAFF与TACI作用的影响,得出M208、G209、H210、Q234、M236、P237是TACI识别BAFF的关键位点。(2)通过分子生物学定点诱变技术将论述模拟的重要位点构建为原核表达载体；体外表达纯化得到高纯度的目的蛋白,同样的策略证实单点突变体在溶液中仍以三聚体形式有着；(3)经ELISA、蛋白相互作用动力学浅析评价突变体的结合能力,发现M208、G209、H210、M236、P237突变后rhBAFF与TACI的相互作用能显著降低。同时,活性浅析实验的结果与结合实验相符,证实M208、G209、M236、P237在BAFF结合TACI介导的生物功能中作用明确,并确定P237为BAFF的关键功能位点；结论：基于计算机辅助分子模拟技术与生物学实验有机结合,通过预测BAFF与受体相互作用复合物空间构象的结构特点以及动态识别方式,合理设计BAFF突变体并进行体外生物学活性评价,成功确定了BAFF与受体相互识别的功能位点,为进一步合理设计、改造BAFF拮抗剂奠定了基础。关键词：BAFF论文受体论文功能位点论文分子对接论文计算机辅助分子模拟论文
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摘要6-10
Abstract10-15
前言15-18
第一章 BAFF与受体TACI的表达纯化及功能活性鉴定18-30
第一节 重组BAFF及重组TACI可溶蛋白的表达纯化及活性鉴定18-30
第二章 BAFF与受体TACI功能结合域的论述预测和验证30-61
第一节、TACI与BAFF作用复合物的结构模拟30-38
第二节、重组BAFF区域突变体蛋白的克隆、表达和鉴定38-52
第三节、与TACI特异结合的BAFF功能域的探讨52-61
第三章 BAFF与TACI相互作用的功能结合域中关键位点的探讨61-76
第一节、TACI识别BAFF关键位点的论述预测61-65
第二节、BAFF功能域关键位点突变体的构建、表达纯化及鉴定65-70
第三节、BAFF功能结构域关键位点的验证及功能评价70-76
总结76-77
参考文献77-81
综述81-90
参考文献87-90
个人简历90
攻读硕士学位期间取得成果90-91
致谢91-92
摘要：B细胞激活因子(B cell activating factor, BAFF)是1999年发现的TNF超家族成员之一,它可特异性的刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体,对B细胞的存活和发育起到重要的调控作用。BAFF-R(BR3)、TACI、BCMA分别是BAFF的三个受体,它们分布在B细胞分化发育的不同时期,BAFF正是通过这些受体在B细胞分化发育的各个阶段及免疫调节中发挥的作用。探讨表明：BAFF缺乏会导致外周B细胞成熟缺陷和降低免疫球蛋白的水平；而BAFF过表达则会破坏免疫耐受,与许多自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE), sjogren氏综合症,类风湿关节炎(RA)的发生、进展密切相关。由此,BAFF及其受体作为治疗自身免疫疾病的特异性靶标,受到广泛的关注。受体TACI与BAFF具有高亲和力,它可以特异性识别BAFF并与之结合。由此,可溶性受体融合蛋白(TACI-Fc)可作为BAFF抑制剂治疗自身免疫疾病,目前该抑制剂已经进入临床试验阶段并取得初步成效。同时,新型拮抗剂开发已成为目前的探讨热点。然而,BAFF是如何识别TACI发挥功能尚不十分清楚,确定BAFF与TACI相互作用的关键功能位点对于研制新型拮抗剂具有重要的指导作用。本探讨基于配体(BAFF)和受体(TACI)晶体结构以及论述模拟获得的三维构象,借助计算机辅助分子对接技术、动力学模拟技术构建配体-受体相互作用的复合物模型,通过计算机模拟的方式浅析TACI与BAFF的结合方式以及BAFF被TACI识别的关键区域。利用分子生物学突变实验以及功能评价策略对论述预测的抗原表位进行实验验证。具体工作如下：一、通过分子生物学、免疫学等策略完成人BAFF蛋白胞外段的表达纯化及活性鉴定。(1)将实验室保存的pET32a(+)/BAFF、pET32a(+)/TACI质粒进行原核表达、通过融合蛋白上携带的His标签进行镍离子亲和纯化,将获得的蛋白(rhBAFF、rhTACI)通过SDS-PAGE及Western Blot完成特异性鉴定；(2)通过非还原电泳、Western Blot、HPLC对rhBAFF在PBS缓冲液中的有着形式做了浅析；(3)用ELISA策略检测了rhBAFF与rhTACI的结合活性,并与商品化蛋白进行了比较；(4)通过小鼠B细胞增殖实验在体外验证了rhBAFF的功能活性；二、借助计算机模拟的策略、通过生物学实验验证确定rhBAFF与TACI相互作用的重要区域。(1)借助BAFF以及受体TACI晶体结构,选择合适的力场参数,在考虑溶剂效应的情况下,利用计算机辅助分子对接技术经动力学模拟构建BAFF与受体相互作用空间构象；(2)利用分子生物学策略构建rhBAFF区域突变体的原核表达载体,在体外表达纯化及鉴定并通过非还原电泳和HPLC的策略鉴定三聚体结构；(3)通过ELISA及Octet蛋白相互作用动力学浅析比较rhBAFF、rhBAFF区域突变体与TACI的结合能力的差别；(4)通过小鼠B细胞增殖实验以及经典NF-κB的激活实验在体外评判rhBAFF与突变体功能活性的差别,确定TACI识别BAFF的功能域；三、在确定rhBAFF功能域的基础上进一步对功能域中每个氨基酸位点进行论述模拟,选择关键位点进行探讨,经实验评价确定了rhBAFF与TACI相互作用功能域的重要位点。(1)利用获得的TACI与BAFF作用复合物空间结构,通过计算机辅助虚拟突变技术对203～211、233～238结构域进行逐点虚拟扫描突变,通过相互作用能量的变化进而预测TACI识别BAFF的关键位点。(2)利用分子生物学策略构建rhBAFF单点突变体的原核表达载体,完成突变体的表达纯化及鉴定；(3)通过ELISA及Octet蛋白相互作用动力学浅析比较rhBAFF、rhBAFF单点突变体与TACI的结合能力的差别；(4)通过小鼠B细胞增殖实验以及经典NF-KB的激活实验在体外评判rhBAFF与单点突变体的功能活性差别确定TACI识别BAFF的关键功能位点；具体结果如下：一、获得了高纯度有活性的人BAFF胞外段及受体TACI胞外段的重组融合蛋白(1)经原核表达、亲和纯化,获得rhBAFF、rhTACI的可溶表达蛋白,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,所表达蛋白的纯度高、特异性强；(2)论文导读：关键位点的验证及功能评价70-76总结76-77参考文献77-81综述81-90参考文献87-90个人简历90攻读硕士学位期间取得成果90-91致谢91-92上一页12
经非还原电泳、Western Blot、HPLC浅析rhBAFF在PBS缓冲液中的确为三聚体形式有着且纯度超过90%；(3)用ELISA双夹心法证实rhBAFF能够特异性的结合rhTACI,与商品化蛋白相比无显著差别；(4)通过小鼠B细胞增殖实验在体外验证了rhBAFF的促增殖活性；二、明确了BAFF与TACI相互作用的关键功能区域(1)利用获得的BAFF与受体作用复合物空间构象,通过分子间氢键形成论述、距离几何学以及计算机图形学技术以论述上合理判别BAFF受体TACI识别BAFF的功能位点；在合理考虑BAFF二级结构以及分子内氢键的条件下,通过计算机辅助分子模拟合理设计BAFF的五个区域突变体；(2)构建了rhBAFF(突变体)／pET32a(+)的原核表达载体；成功表达rhBAFF的片段突变体：M1(158-165)、M2(203-211)、M3(225-231)M4(233-238)、M5(264-269),并通过镍离子亲和介质纯化得到高纯度的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确,Western印迹和HPLC的结果证实在非还原条件下突变体的分子量约为110bp,均为三聚体形式；(3) ELISA与蛋白相互作用动力学浅析结果表明突变体M2、M4、M5的结合TACI的能力显著降低。小鼠B淋巴细胞增殖试验和经典NF-κB激活实验结果显示,突变体M2、M4与rhBAFF相比的生物学活性显著降低,初步确定rhBAFF的突变体M2、M4突变的区域203-211,233-238为BAFF的功能区域；三、明确了rhBAFF与TACI相互作用功能域的关键位点(1)通过虚拟单点突变对BAFF与TACI相互识别的关键位置(M2、M4)进行论述预测,经相互作用能的变化动态浅析了单点突变对BAFF构象以及BAFF与TACI作用的影响,得出M208、G209、H210、Q234、M236、P237是TACI识别BAFF的关键位点。(2)通过分子生物学定点诱变技术将论述模拟的重要位点构建为原核表达载体；体外表达纯化得到高纯度的目的蛋白,同样的策略证实单点突变体在溶液中仍以三聚体形式有着；(3)经ELISA、蛋白相互作用动力学浅析评价突变体的结合能力,发现M208、G209、H210、M236、P237突变后rhBAFF与TACI的相互作用能显著降低。同时,活性浅析实验的结果与结合实验相符,证实M208、G209、M236、P237在BAFF结合TACI介导的生物功能中作用明确,并确定P237为BAFF的关键功能位点；结论：基于计算机辅助分子模拟技术与生物学实验有机结合,通过预测BAFF与受体相互作用复合物空间构象的结构特点以及动态识别方式,合理设计BAFF突变体并进行体外生物学活性评价,成功确定了BAFF与受体相互识别的功能位点,为进一步合理设计、改造BAFF拮抗剂奠定了基础。关键词：BAFF论文受体论文功能位点论文分子对接论文计算机辅助分子模拟论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。英文縮略词表4-6
摘要6-10
Abstract10-15
前言15-18
第一章 BAFF与受体TACI的表达纯化及功能活性鉴定18-30
第一节 重组BAFF及重组TACI可溶蛋白的表达纯化及活性鉴定18-30
第二章 BAFF与受体TACI功能结合域的论述预测和验证30-61
第一节、TACI与BAFF作用复合物的结构模拟30-38
第二节、重组BAFF区域突变体蛋白的克隆、表达和鉴定38-52
第三节、与TACI特异结合的BAFF功能域的探讨52-61
第三章 BAFF与TACI相互作用的功能结合域中关键位点的探讨61-76
第一节、TACI识别BAFF关键位点的论述预测61-65
第二节、BAFF功能域关键位点突变体的构建、表达纯化及鉴定65-70
第三节、BAFF功能结构域关键位点的验证及功能评价70-76
总结76-77
参考文献77-81
综述81-90
参考文献87-90
个人简历90
攻读硕士学位期间取得成果90-91
致谢91-92