简谈微管微管蛋白抑制剂SUD包合物脂质体制备及其初步药效学和药动学

论文导读：n,XRD）法对所得到的包合物进行鉴定。在文献和预实验的基础上初步确定SUD-HP-β-CD包合物脂质体的制备策略和处方，通过单因素考察初步确定脂质体制备的影响因素，并探讨不同包封率测定策略对包封率测定结果的影响；采取薄膜分散法、注入法、逆向蒸发法、复乳法四种策略制备脂质体，利用葡聚糖凝胶柱对脂质体与未包封游离药物进行
摘要：目的：环糊精和脂质体（pposomes）作为药物的载体，可有效地提升药物的生物利用度和治疗指数。脂质体是一种具有类生物膜结构的双分子层微囊，是一种定向药物载体,属于靶向给药系统（targeting drug depverysystem）的一种新型给药系统。其进入体内后主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并且通过转变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺等组织器官中蓄积，并能优先聚集于肿瘤、炎症、感染等部位，以而提升药物治疗指数，减少治疗剂量并降低药物的毒性；但脂质体在包埋药物尤其是疏水性药物时往往受到药脂比等因素的限制，并且某些疏水性药物可能会干扰脂质双层的结构，影响脂质体的稳定性，使其在贮存历程发生药物泄漏。脂质体包封疏水性药物有着的这些不足在一定程度上限制了它的运用。环糊精(cyclodextrins，CYD)的特殊结构使其可与和疏水性药物形成包合物，增加难溶性药物的溶解度，提升其生物利用度。近年来的探讨发现，利用环糊精与脂质体各自具备的优点，制备环糊精包合物脂质体，可以提升脂质体的稳定性,减少药物泄漏,提升载药量,转变药物的体内行为,同时使其具有缓释性和靶向性。本实验以全合成的新型小分子化合物N-[4-（4,6二-2-嘧啶氧基）-3-]-N’-[2-（二甲氨基）]苯甲酰脲(SUD)为疏水性药物模型，探讨材料组成、制备工艺对包合物-脂质体包封率的影响，考察其理化性质、体外释药情况、大鼠体内药物动力学行为及小鼠的体内分布，为这一新型给药系统的运用提供实验基础。并采取药理学试验策略进一步探讨其脂质体给药系统对人肺腺癌A549细胞体外增殖的影响，为其作为抗肿瘤药物运用于临床提供实验依据。策略：以羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)为包合材料，分别用饱和水溶液法和研磨法制备了SUD-HP-β-CD包合物，通过对包合率及产率的评价，最后采取饱和水溶液法制备，通过四因素三水平正交实验设计对制备工艺进行优化，对包合率测定结果进行极差浅析，最后确定SUD-HP-β-CD包合物的最佳处方工艺，并采取差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)和X射线粉末衍射（X-raydiffraction, XRD）法对所得到的包合物进行鉴定。在文献和预实验的基础上初步确定SUD-HP-β-CD包合物脂质体的制备策略和处方，通过单因素考察初步确定脂质体制备的影响因素，并探讨不同包封率测定策略对包封率测定结果的影响；采取薄膜分散法、注入法、逆向蒸发法、复乳法四种策略制备脂质体，利用葡聚糖凝胶柱对脂质体与未包封游离药物进行分离。测定包封率，最终确定薄膜分散法为SUD-HP-β-CD包合物脂质体的制备策略。以包封率为考察指标，通过单因素考察优化脂质体的制备工艺，并考察磷脂浓度、磷脂与胆固醇质量比、水化液类型、药物与磷脂质量比等因素对脂质体的影响。在此基础上，采取四因素三水平正交试验对各因素的水平进行筛选，对包封率测定结果进行极差浅析，最后确定SUD-HP-β-CD包合物脂质体的最佳处方。考察按照优化处方制备的SUD-HP-β-CD包合物脂质体的形态外观，粒径分布及黏度等指标，考察其理化稳定性。分别绘制SUD-HP-β-CD包合物脂质体和SUD-HP-β-CD包合物的体外释药曲线并比较其体外释药历程，分别用零级、一级、Higuchi及Weibull动力学方程进行拟合，并考察相联系数。以高效液相法测定大鼠血浆及小鼠组织中SUD-HP-β-CD包合物脂质体浓度。液相条件：色谱柱：Diamonsil~(TM)ODS C_(18)()250×4.6mm，5μm；以甲醇:水(80:20)v/v为流动相；检测波长为232nm；柱温：30℃；流速：1mL·min~(-1)；进样量为20μL。对结果进行处理，计算大鼠体内各种药动学参数，考察SUD-HP-β-CD包合物脂质体在小鼠体内分布，并进行靶向性评价。常规培养人肺腺癌A549细胞，采取MTT法测定SUD-HP-β-CD包合物脂质体对A549细胞增殖的抑制作用。流式细胞仪测定细胞周期分布。Western blot法测定细胞增殖核抗原（PCNA）及细胞周期蛋白（cycpn D1）蛋白表达。初步探讨SUD-HP-β-CD包合物脂质体对人肺腺癌A549细胞体外增殖的影响。结果：采取饱和水溶液法制备SUD-HP-β-CD包合物包合率较高，最佳制备工艺为SUD与HP-β-CD投料比为1:5，包合温度为50℃，包合时间为90min，搅拌速度100转/min，平均包合率为75.8%（n=3）DSC法对包合物进行鉴定，发现SUD-HP-β-CD包合物在105℃出现新的吸热峰。在XRD图中，SUD经包合后，SUD的部分特点衍射峰消失或位移,表明确实形成了包合物。通过单因素考察和正交实验，筛选出了SUD-HP-β-CD包合物脂质体的最优处方为磷脂50mg·mL~(-1)，磷脂与胆固醇质量比5:1，药脂比为1:30。根据优化处方制备的SUD-HP-β-CD包合物脂质体外观为均匀的乳白色混悬液，包封率为76.32%，平均粒径约为238.4nm，多分散性系数为0.258。SUD-HP-β-CD包合物溶液的体外释药最符合Weibull方程，为ln[-ln(1-Q)]=0.9045lnt~(-1).4335， r~2=0.9861。SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体混悬液体外释药符合一级动力学方程，为ln(1-Q)=-0.0824t+0.0517，r2=0.9893。稳定性结果显示：脂质体在加热条件下不稳定；25℃条件下存放一个月，包封率下降33.6%，脂质体沉淀分层显著；在4℃条件下存放一个月，包封率下降1.7%，稳定性较好，说明脂质体需在冷藏条件下保存。药动学实验表明：SUD溶液和SUD-HP-β-CD包合物脂质体静脉给药后，脂质体组消除速率常数k为0.22h~(-1)，溶液组的k为论文导读：
0.41h~(-1)，说明制成脂质体后SUD在大鼠体内的消除减慢。脂质体组AUC为517.54μg·h·mL~(-1)，溶液组AUC为228.72μg·h·mL~(-1)，表明脂质体增加了药物在机体中的生物利用度。小鼠体内分布实验表明：SUD-HP-β-CD包合物脂质体较溶液在心、脾和肺中的药物浓度有较大增高，脂质体组中心、脾、肺的re分别为3.01、3.14、2.71，说明脂质体经静脉注射后在心、脾、肺组织有一定浓集，起到了一定的靶向目的。MTT实验结果表明，SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体对A549细胞瘤株的生长有显著的抑制作用，随着浓度增加和作用时间的延长，对细胞增殖的抑制作用逐渐增强。流式细胞仪检测细胞周期结果表明：不同浓度含药脂质体作用48h对A549细胞周期分布均有不同程度的影响，与空白对照组相比，1、5、10μg·mL~(-1)SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体组G_0/G_1期细胞百分率均显著增加（P0.05或P0.01）。其中5、10μg·mL~(-1)SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体组S期细胞百分率显著降低（P 0.01）。10μg/mL SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体组G_2/M期细胞百分率也显著降低（P 0.01）。说明SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体可使A549细胞停滞在G_0/G_1期，以而抑制细胞增殖。Western blot结果显示，与空白对照组相比，空白脂质体对PCNA、cycpn D1蛋白表达均没有显著影响。而5μg·mL~(-1)SUD原药以及1、5、10μg·mL~(-1)SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体作用于A549细胞48h均不同程度地下调了PCNA和cycpn D1的蛋白表达(P0.05或P0.01)。结论：以HP-β-CD为包合材料，以饱和水溶液法制备SUD-HP-β-CD包合物；以磷脂、胆固醇为主要膜材，以薄膜分散法制备SUD-HP-β-CD包合物脂质体，制备工艺简单，质量可控，重现性好，可提升药物靶向性，以而降低毒副作用，有望开发成为有良好运用前景的新剂型。SUD-HP-β-CD包合物脂质体给药系统对人肺腺癌A549细胞体外增殖有显著的抑制作用，使细胞周期停滞于G_0/G_1期，还显著下调了PCNA和cycpn D1的蛋白表达，为其作为抗肿瘤药物运用于临床提供实验依据。关键词：微管蛋白抑制剂论文苯甲酰脲论文包合物论文脂质体论文包封率论文薄膜分散法论文药物动力学论文组织分布论文靶向论文细胞毒性论文药效学论文
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英文摘要9-14
引言14-16
第一部分 微管蛋白抑制剂 SUD 包合物的制备16-31
前言16-17
材料与策略17-21
结果21-23
附图23-25
附表25-28
讨论28-29
小结29-30
参考文献30-31
第二部分 SUD-HP-β-CD 环糊精包合物脂质体的制备31-55
前言31-32
材料与策略32-38
结果38-41
附图41-46
附表46-51
讨论51
小结51-52
参考文献52-55
第三部分 SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体的理化性质探讨及稳定性考察55-69
前言55-56
材料与策略56-59
结果59-61
附图61-63
附表63-66
讨论66
小结66-67
参考文献67-69
第四部分 SUD-HP-β-环糊精包合物脂质体的药动学初步探讨69-96
前言69-70
材料与策略70-74
结果74-75
附图75-81
附表81-92
讨论92-93
小结93-94
参考文献94-96
第五部分 SUD- HP-β-环糊精包合物脂质体体外抗肿瘤作用探讨96-119
前言96-97
材料与策略97-104
结果104-106
附图106-111
附表111-114
讨论114-116
小结116-117
参考文献117-119
结论119-120
综述 抗肿瘤药物脂质体的临床探讨与运用进展120-136
参考文献131-136
致谢136-137
个人简历137