论损伤纳米材料PAMAMG3及甲型H1N1流感病毒导致小鼠急性肺损伤致病机理

论文导读：纳米材料论文自噬论文急性肺损伤论文甲型H1N1流感病毒论文细胞因子风暴论文急性肺损伤论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。目录3-10图表目录10-12第一部分纳米材料PAMAMG3诱导小鼠急性肺损伤的致病机理探讨12-41中文摘要12-13英文
摘要：纳米材料PAMAM G3引起A549细胞自噬性死亡,并导致小鼠急性肺损伤作为一项重要的和新兴的产业,纳米技术正逐步以探讨领域涉及到日常生产生活。然而,直到最近,人们才开始关注纳米材料对人体及环境的安全性不足。已经有探讨称：纳米材料可以造成肺部的疾病或损伤,但其所导致的肺部损伤的分子机制却仍然没有被揭示出来。本论文所探讨的纳米材料是一种具有高度支化、对称、呈辐射状的大分子——聚酰胺-胺树枝状大分子纳米材料(PAMAM dendrimer)。它由中心核、内层重复的分支亚单位以及表面的功能基团组成。整代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为氨基,半代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为羧基。由于氨基带有正电荷,整代的PAMAM常被用作载体,递送DNA,进行细胞或生物体内表达。对于这些PAMAM材料生物安全性的探讨甚少。本论文中,我们测定了PAMAM G1～G8以及G3.5、G4.5、G5.5和G7.5对A549细胞的影响。发现以PAMAM G3到PAMAM G8均会引起A549细胞的死亡。而表面基因为阴离子的半代PAMAM对A549细胞的活性不会产生影响。我们对PAMAM G3引起的A549细胞死亡进行了浅析,发现PAMAM G3不是通过凋亡通路引起的A549细胞死亡,而是引起细胞自噬性死亡。给予自噬的抑制剂3MA或是利用siRNA技术抑制自噬基因ATG6的表达,可以有效地缓解PAMAM G3引起的A549细胞死亡。同时,自噬性细胞死亡也在PAMAM G4、G5.G6、G7和G8引起的A549细胞死亡中扮演着重要角色。同时,我们对PAMAM G3引起的自噬性细胞死亡的信号通路进行了浅析。发现PAMAM G3通过Akt-TSC2-mTOR的信号通路引起A549发生自噬性细胞死亡。此外,我们发现PAMAM G3会导致小鼠死亡,引起小鼠急性肺损伤。而自噬的抑制剂3MA有效地缓解PAMAM G3引起的小鼠死亡,改善小鼠的急性肺损伤程度。说明自噬在PAMAM G3引起的小鼠死亡中发挥着重要作用。甲型H1N1流感病毒导致小鼠急性肺损伤的致病机理探讨2009年3月,以美国和墨西哥流感样患者呼吸道标本中,鉴定出新的猪源性甲型H1N1流感病毒。该病毒可在人际间传播,已蔓延100多个国家、地区。人感染后的主要临床体现为急性呼吸道感染症状,部分患者病情进展迅速,继发急性呼吸窘迫综合征、肺出血、呼吸衰竭和多器官损伤,导致死亡。感染甲型H1N1流感病毒导致的急性呼吸系统损伤的致病机制尚不清楚。本探讨通过建立甲型H1N1流感病毒感染的小鼠模型,揭示NF-K B信号的激活,可诱发炎症相关因子产生,形成细胞因子风暴(Cytokine storm),在小鼠感染病毒后导致的急性肺损伤中发挥重要致病作用。通过检测小鼠的死亡率、肺组织湿干比、肺组织病理、支气管肺泡灌洗液中的炎症相关因子以及肺组织中单核巨噬细胞磷酸化NF-κB及IκB-α的表达等指标,比较不同流行株的甲型H1N1流感病毒对不同周龄、不同品系小鼠的致病性。结果表明：与CA07株甲型H1N1流感病毒比较,BJ株对4周龄的C57BL/6小鼠具有更强的致肺损伤能力,其在小鼠肺组织中的复制能力也显著高于CA07株甲型H1N1流感病毒。感染甲型H1N1流感病毒BJ株的小鼠,在连续给予糖皮质激素地塞米松治疗后,其死亡率有显著降低,肺组织损伤也得到显著缓解,说明激素抑制了剧烈的炎症反应,降低了小鼠的急性肺损伤程度。上面陈述的结果的阐明,为了解甲型H1N1流感病毒导致的急性肺损伤致病机理,并临床上治疗甲型流感病毒导致的急性呼吸系统损伤提供了重要信息。关键词：纳米材料论文自噬论文急性肺损伤论文甲型H1N1流感病毒论文细胞因子风暴论文急性肺损伤论文
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图表目录10-12
第一部分 纳米材料PAMAM G3诱导小鼠急性肺损伤的致病机理探讨12-41
中文摘要12-13
英文摘要13-14
前言14-18

一、实验材料与策略18-27

第一节 纳米材料PAMAM对人肺上皮细胞(A549细胞)的毒性18-20
1 材料18

1.1 细胞18

1.2 纳米材料18

1.3 细胞培养用耗材18

1.4 实验试剂18

1.5 实验设备18

2 策略18-20

2.1 PAMAM纳米材料的处理18-19

2.2 MTT策略测定PAMAM纳米材料对细胞活性的影响19

2.3 细胞全DNA基因组提取19

2.4 Caspase-3活性测定19-20

第二节 纳米材料PAMAM诱导人肺上皮细胞(A549细胞)自噬性死亡20-23
1 材料20-21

1.1 细胞20

1.2 纳米材料20

1.3 质粒20

1.4 细胞培养用耗材20

1.5 实验药物及试剂20-21

1.6 实验设备21

2 策略21-23

2.1 PAMAM G3导致A549细胞产生自噬的电镜实验21-22

2.2 PAMAM G3引起A549细胞EGFP-LC3聚集实验22

2.3 Western blotting检测A549细胞自噬标志性蛋白LC3的表达水平变化22

2.4 MTT策略测定PAMAM纳米材料对细胞活性的影响22

2.5 RNAi技术干扰自噬关键基因ATG6的表达后,测定A549细胞活性22-23
第三节 纳米材料PAMAM G3激活Akt-TSC2-mTOR通路诱导人肺上皮细胞(A549细胞)自噬性死亡23-25
1 材料23-24

1.1 细胞23

1.2 纳米材料23

1.3 质粒23

1.4 细胞培养用耗材23

1.5 实验药物及试剂23

1.6 实验设备23-24

2 策略24-25
2.1 Western blotting检测A549细胞白噬性死亡信号通路蛋白表达水平的变化24
2.2 RNAi技术干扰TSC2基因表达后,检测A549细胞中EGFP-LC3的聚集24
2.3 RNAi技论文导读：作用36-37三、结论37-38四、讨论38-39五、参考文献39-41第二部分甲型H1N1流感病毒致小鼠急性肺损伤的致病机理探讨41-98中文摘要41-42英文摘要42-43前言43-47一、实验材料与策略47-64第一节甲型H1N1流感病毒的培养、浓缩47-481.1材料471.1.1仪器471.1.2试剂471.1.3病毒471.1.4动物471.2策略47-481.2.1活胚检查471.2
术干扰TSC2基因表达后,测定PAMAM G3对细胞活性影响24-25
第四节 纳米材料PAMAM G3诱导自噬性细胞死亡致小鼠急性肺损伤25-27
1 材料25

1.1 动物25

1.2 纳米材料25

1.3 实验药物及试剂25

1.4 实验设备25

2 策略25-27

2.1 小鼠气管内注射PAMAM G3后,肺组织病理观察25-26

2.2 小鼠气管内注射PAMAM G3后,肺组织湿干比变化26

2.3 小鼠气管内注射PAMAM G3后,肺弹性变化26

2.4 小鼠气管内注射PAMAM G3后,死亡率变化26-27

二、实验结果27-37

第一节 纳米材料PAMAM对人肺上皮细胞(A549细胞)的毒性27-29

1.1 纳米材料PAMAM对A549细胞活性的影响27

1.2 纳米材料PAMAM G3处理的A549细胞全DNA基因组电泳结果27-28

1.3 纳米材料PAMAM G3处理的A549细胞Caspase-3活性测定结果28-29
第二节 纳米材料PAMAM诱导人肺上皮细胞(A549细胞)自噬性死亡29-32

2.1 PAMAM G3导致A549细胞产生自噬的电镜照片29

2.2 激光共聚焦浅析PAMAM G3引起A549细胞发生自噬EGFP-LC3聚集29-30

2.3 PAMAM G3引起的A549细胞中LC3蛋白的表达变化30

2.4 自噬抑制剂3MA改善PAMAM G3引起的自噬性细胞死亡30-31

2.5 抑制自噬关键基因ATG6的表达后,加入PAMAM G3测定A549细胞活性31-32
第三节 PAMAM G3激活Akt-TSC2-mTOR通路诱导细胞自噬性死亡32-35
3.1 Western blotting检测A549细胞自噬性死亡信号通中mTOR表达变化32
3.2 Western blotting检测A549细胞自噬性死亡信号通中S6表达变化32-33
3.3 抑制TSC2基因表达后,加入PAMAM G3检测细胞EGFP-LC3的聚集33
3.4 抑制TSC2基因表达,加入PAMAM G3后测定A549细胞的活性33-34
3.5 Western blotting检测A549细胞自噬性死亡的信号通路Akt表达变化34

3.6 PAMAM G3引起A549细胞自噬性死亡的信号通路方式图34-35

第四节 纳米材料PAMAM G3诱导自噬性细胞死亡致小鼠急性肺损伤35-37

4.1 PAMAM G3引起小鼠肺组织的病理转变35

4.2 PAMAM G3引起小鼠肺组织湿干比变化35-36

4.3 PAMAM G3引起小鼠肺弹性的变化36

4.4 PAMAM G3对小鼠存活情况的影响以及3MA的改善作用36-37

三、结论37-38

四、讨论38-39

五、参考文献39-41

第二部分 甲型H1N1流感病毒致小鼠急性肺损伤的致病机理探讨41-98
中文摘要41-42
英文摘要42-43
前言43-47

一、实验材料与策略47-64

第一节 甲型H1N1流感病毒的培养、浓缩47-48

1.1 材料47

1.1 仪器47

1.2 试剂47

1.3 病毒47

1.4 动物47

1.2 策略47-48

1.2.1 活胚检查47

1.2.2 鸡胚尿囊腔接种47-48

1.2.3 甲型H1N1流感病毒的收获48

1.2.4 鸡胚尿囊液中病毒的粗离48

1.2.5 超速离心法浓缩流感病毒48

第二节 甲型H1N1流感病毒的血凝单位及50%培养组织感染剂量测定48-51

2.1 材料48-49

2.

1.1 仪器48-49

2.

1.2 试剂49

2.

1.3 病毒49

2.

1.4 细胞49

2.2 策略49-51

2.1 制备1%鸡红细胞悬液49

2.2 MDCK细胞的培养49-50

2.3 甲型H1N1流感病毒的血凝单位测定50

2.4 甲型H1N1流感病毒50%培养组织感染剂量(TCID50)的测定50-51

第三节 甲型H1N1流感病毒感染小鼠及50%致死剂量(LD50)的测定51-52

3.1 材料51

3.

1.1 仪器51

3.

1.2 试剂51

3.

1.3 病毒51

3.

1.4 动物51

3.2 策略51-52
3.

2.1 甲型H1N1流感病毒鼻腔内感染小鼠51-52

3.

2.2 小鼠50%致死剂量(LD50)的测定52

第四节 甲型H1N1流感病毒(BJ株)致小鼠急性肺损伤模型的建立52-55

4.1 材料52

4.

1.1 仪器52

4.

1.2 试剂52

4.

1.3 病毒52

4.

1.4 动物52

4.2 策略52-55
4.

2.1 甲型H1N1流感病毒(BJ株)致小鼠死亡率53

4.

2.2 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染小鼠后肺脏中病毒的滴度测定53

4.

2.3 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染小鼠后的肺组织病理53-54

4.

2.4 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染小鼠后的肺组织湿干比54

4.

2.5 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染后支气管肺泡灌洗液炎症因子检测54-55

4.

2.6 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染小鼠后IκB-α激活55

第五节 不同株甲型H1N1流感病毒对4周龄C57 BL/6小鼠致病性比较55-59

5.1 材料55-56

5.

1.1 仪器55

5.

1.2 试剂55-56

5.

1.3 病毒56

5.

1.4 动物56

5.2 策略56-59
5.

2.1 不同株甲型H1N1流感病毒致小鼠死亡率56

5.

2.2 不同株甲型H1N1流感病毒感染后小鼠肺脏中病毒的滴度测定56-57

5.

2.3 不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺组织病理57

5.

2.4 不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺组织湿干比57

5.

2.5 不同株甲型H1N1流感病毒感染后支气管肺泡灌洗液炎症因了检测57-58

5.

2.6 不同株甲型H1N1流感病毒感染后NF-κB和IκB-α的表达浅析58-59

第六节 甲型H1N1流感病毒对不同品系,不同周龄小鼠致病性比较59-62

6.1 材料59

6.

1.1 仪器59

6.

1.2 试剂59

6.

1.3 病毒59

6.

1.4 动物59

6.2 策略59-62
6.2.1 不同种系,不同周龄小鼠50%致死剂量(LD5论文导读：的滴度测定78-795.3不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺组织病理79-815.4不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺组织湿干比815.5不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的支气管肺泡灌洗液炎症因子检测815.6不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠NF-κB和IκB-α的激活81-83第六节甲型H1N1流感病毒对不同种系,不同周龄小鼠致病性比较83
0)的测定59-60
6.

2.2 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)致小鼠死亡率60

6.

2.3 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)感染后小鼠的肺组织湿干比60

6.2.4 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)感染小鼠的支气管肺泡灌洗液炎症因子的测定60-61
6.2.5 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)感染后IκB-α表达水平检测61-62
第七节 药物治疗甲型H1N1流感病毒感染引起的小鼠急性肺损伤62-64

7.1 材料62

7.

1.1 仪器62

7.

1.2 试剂62

7.

1.3 病毒62

7.

1.4 动物62

7.2 策略62-64
7.

2.1 药物治疗降低甲型H1N1流感病毒(BJ株)病毒致小鼠死亡率62

7.

2.2 药物治疗甲型H1N1流感病毒(BJ株)病毒感染小鼠的肺组织病理62-63

7.

2.3 药物缓解甲型H1N1流感病毒(BJ株)病毒感染后小鼠的肺组织水肿63-64

二、实验结果64-94

第二节 血凝单位及50%培养组织感染剂量TCID50测定64

2.1 甲型H1N1流感病毒的血凝单位测定结果64

2.2 甲型H1N1流感病毒50%培养组织感染剂量的测定结果64

第三节 甲型H1N1流感病毒感染小鼠及50%致死剂量的测定64-65
3.1 甲型H1N1流感病毒对4周龄C57BL/6小鼠50%致死(测定结果64-65
第四节 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染致小鼠急性肺损伤模型的建立65-77

4.1 甲型H1N1流感病毒(BJ株)致小鼠死亡率65

4.2 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染后小鼠肺脏中病毒的滴度65-66

4.3 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染小鼠的肺组织病理结果66-68

4.4 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染后小鼠的肺组织湿干比68-69

4.5 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染后炎症因子的测定69-76

4.6 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染小鼠IκB-α激活76-77

第五节 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)对小鼠致病性比较77-83

5.1 不同株甲型H1N1流感病毒致小鼠死亡率结果77-78

5.2 不同株甲型H1N1流感病毒感染后小鼠肺脏中病毒的滴度测定78-79

5.3 不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺组织病理79-81

5.4 不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺组织湿干比81

5.5 不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠的支气管肺泡灌洗液炎症因子检测81

5.6 不同株甲型H1N1流感病毒感染小鼠NF-κB和IκB-α的激活81-83

第六节 甲型H1N1流感病毒对不同种系,不同周龄小鼠致病性比较83-90

6.1 不同种系、不同周龄小鼠50%致死剂量(LD_(50))的测定83

6.2 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)致小鼠死亡率83-84

6.3 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)感染小鼠的肺组织干湿十比84-85
6.4 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)感染小鼠的支气管肺泡灌洗液炎症因子的测定85-89
6.5 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)感染小鼠的IκB-α的激活89-90
第七节 药物治疗甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染引起的小鼠急性肺损伤90-94

7.1 药物治疗降低甲型H1N1流感病毒(BJ株)病毒致小鼠死亡率90-91

7.2 药物治疗甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染小鼠的肺组织病理变化91-93

7.3 药物缓解甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染后小鼠的肺组织水肿93-94

三、结论94-95

四、讨论95-96

五、参考文献96-98

综述一98-110
参考文献107-110
综述二110-119
参考文献115-119
英文略语表119-121
致谢121-122
个人简历122-123