谈调控乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对人FABP1和NQO1基因调控及机制

论文导读：人FABP1自身的调控，为此，构建了FABP1基因启动子区全长（-2125nt~+50nt）及各分段报告基因重组表达载体，结果表明-255nt~+50nt区域保留FABP1启动子最大活性并且在性细胞系HepG2细胞中活性最高；采取TFSEARCH和TESS在线软件预测启动子区域潜在的转录因子结合位点，发现-255nt~-155nt区域包含了两个肝细胞富集因子：肝细胞核因子
摘要：乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）导致急慢性乙型肝炎，并与肝硬化和肝细胞癌（Hepatocelluar carcinoma, HCC)密切相关，但其确切机制尚未完全阐明。HBx蛋白由HBV基因组X开放读码框(ORF)编码，大小为Da，是HBV最重要的致病因子。作为一种多功能的病毒蛋白，HBx蛋白一直以来均为肝脏相关疾病的探讨热点。HBx不与双链DNA直接结合，主要通过与转录因子相互作用来调控基因的表达。近年来的探讨发现，HBx还可以通过表观遗传学修饰调控细胞内一些基因的转录活性，HBx被认为是肝细胞内一些基因表达沉默的潜在促发因素。本课题组先前通过2D-DIGE（fluorescence two-dimensionaldifference gel electrophoresis）和MALDI-TOF/TOF MS技术检测了HepG2-HBV3（产生HBV的HepG2细胞株，本实验室构建）和HepG2-RepSal1（对照）两株细胞株总蛋白表达谱的差别，提示HBV可提升肝型脂肪酸结合蛋白（pver fattyacid binding protein，L-FABP，也称为FABP1）的表达，并降低NAD(P)H醌氧化还原酶1(NAD(P)H dehydrogenase:quinone1，NQO1)的表达。本探讨在此基础上，进一步探讨HBx影响FABP1及NQO1转录及表达的调控机制，有助于更深入了解HBV的致病机制。本探讨第一部分旨在验证HBV特别是HBx对FABP1、NQO1的转录及表达的影响。通过HBV细胞株及瞬时转染1.2×HBV基因组DNA的策略，同时构建Flag-HBx融合表达腺病毒Ad-HBx，采取realtime RT-PCR和Western blot检测FABP1和NQO1的mRNA和蛋白水平的变化，证实HBV及HBx能够上调FABP1基因转录和表达，并下调NQO1基因转录及表达。本探讨第二部分旨在探讨HBx上调FABP1基因转录及表达的机制。在本部分第一章，我们首先探讨人FABP1自身的调控，为此，构建了FABP1基因启动子区全长（-2125nt~+50nt）及各分段报告基因重组表达载体，结果表明-255nt~+50nt区域保留FABP1启动子最大活性并且在性细胞系HepG2细胞中活性最高；采取TFSEARCH和TESS在线软件预测启动子区域潜在的转录因子结合位点，发现-255nt~-155nt区域包含了两个肝细胞富集因子：肝细胞核因子3β（hepatocyte nuclear factor3β， HNF3β）和CCAAT/增强结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα）；通过构建HNF3β和C/EBPα结合位点突变体等策略确定HNF3β和C/EBPα增强FABP1基因转录；在此基础上，凝胶阻滞实验和染色质免疫共沉淀实验表明HNF3β和C/EBPα特异结合于FABP1的启动子区域；此外，构建HNF3β和C/EBPα过表达载体转染HepG2细胞可以使FABP1转录增强进而导致FABP1表达增强；相反地，敲除HNF3β和C/EBPα则使FABP1转录及表达降低。本部分第二章，进一步探讨HBx通过HNF3β和C/EBPα影响FABP1表达的机制。通过构建HNF3β和C/EBPα结合位点突变体转染HepG2细胞并感染Ad-HBx，检测细胞内荧光素酶（luciferase）活性，结果表明HNF3β及C/EBPα结合位点突变后使HBx反式激活FABP1基因启动子的活性显著降低；pGL3B-255转染大肠癌细胞HCT-116（此细胞低表达HNF3β及C/EBPα，且不表达FABP1）并感染Ad-HBx，检测胞内luciferase活性并与HepG2细胞比较，结果提示FABP1启动子活性在HCT116细胞中显著低于HepG2细胞；HNF3βsiRNA或C/EBPαsiRNA转染HepG2细胞并感染Ad-HBx，realtime RT-PCR检测FABP1mRNA水平，结果表明HNF3β及C/EBPα转录因子是HBx反式激活FABP1基因启动子的重要作用因子；在此基础上，采取染色质免疫沉淀，免疫共沉淀等策略明确HBx蛋白与HNF3β和C/EBPα的作用方式（直接还是间接），结果提示HBx是通过与C/EBPα相互作用的方式（直接作用）调控FABP1启动子的活性；而HBx通过影响HNF3β的表达（间接作用）调控FABP1启动子的活性。本探讨第三部分旨在探讨HBx下调NQO1基因转录及表达的机制。Ad-HBx分别感染Huh7、HepG2和Hep3B细胞，以三株细胞经过亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA为模板，通过DNA亚硫酸氢盐测序法（Bisulfate DNAsequencing）检测NQO1基因启动子的化水平，发现HBx可以使NQO1启动子高化；通过染色质免疫沉淀等策略检测HBx介导的蛋白质与NQO1启动子区域的结合，结果表明HBx可以通过募集DNMT3A到NQO1的启动子区域而引起NQO1启动子高化；在此基础上，我们在HBV相关的HCC临床标本中也进行了验证，通过realtime RT-PCR和免疫组化发现NQO1mRNA和蛋白水平分别与HBxmRNA和蛋白水平呈负相关；采取化特异性PCR和亚硫酸氢盐测序法对HBx高表达和低表达的组织标本进行检测，发现HBx高表达的组织标本NQO1启动子的化程度显著高于HBx低表达的组织样本，所得结果与细胞模型一致；此外，通过检测内源性活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的产生和H2O2引起的细胞毒性反应，发现HBx下调NQO1基因的表达引起细胞内ROS产生增加和对H2O2的细胞毒性作用更加敏感。关键词：HBV论文HBx论文FABP1论文NQO1论文调控论文
本论文由{#GetFullDoma论文导读：因主要受肝富集因子HNF3β和C/EBPα调控25-59引言25-26材料与策略26-46结果46-56讨论56-58小结58-59第二章HBx对人FABP1的调控机制探讨59-71引言59材料与策略59-62结果62-68讨论68-70小结70-71第三部分乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对人NQO1的调控机制探讨71-93引言71-72材料与策略72-82结果82-91讨论91-93小结93结论93
in},需要论文可以联系人员哦。摘要5-8
Abstract8-11
前言11-14
第一部分 乙型肝炎病毒 X 蛋白(HBx)对人 FABP

1、NQO1 表达的影响14-25

引言14
材料与策略14-20
结果20-22
讨论22-24
小结24-25
第二部分 乙型肝炎病毒 X 蛋白(HBx)对人 FABP1 的调控及机制探讨25-71
第一章 人 FABP1 基因主要受肝富集因子 HNF3β和 C/EBPα调控25-59
引言25-26
材料与策略26-46
结果46-56
讨论56-58
小结58-59
第二章 HBx 对人 FABP1 的调控机制探讨59-71
引言59
材料与策略59-62
结果62-68
讨论68-70
小结70-71
第三部分 乙型肝炎病毒 X 蛋白(HBx)对人 NQO1 的调控机制探讨71-93
引言71-72
材料与策略72-82
结果82-91
讨论91-93
小结93
结论93-94
参考文献94-106
附录

一、英文缩略词表106-109

附录

二、试剂配方109-112

附录

三、主要仪器设备112-113

致谢113-114
攻读学位期间完成的学术论文114-116
综述 非酒精性脂肪肝和肝癌116-128
参考文献123-128