研讨Cdh1基因在牛卵母细胞BD中功能-

论文导读：下结论：ROS抑制后的牛卵母细胞BD进程缩短了大约4h；在期牛卵母细胞中，Cdh1蛋白主要分布于生发泡中，BD发生后，Cdh1蛋白主要分布于染色体和纺锤体所在的区域；在牛卵母细胞中超表达Cdh1基因延迟了BD的发生。关键词：Cdh1论文BD论文牛论文卵母细胞论文Roscovitine论文本论文由{#GetFullDomain
摘要：在哺乳动物卵母细胞减数分裂期阻滞和减数分裂恢复历程中，MPF（CDK1-Cycpn B1）活性的变化起着关键性作用。有报道表明Cdh1基因在小鼠卵母细胞期阻滞历程中发挥重要的作用，APCCdh1通过降解Cycpn B1，防止其在生发泡中积累，以而使CDK1处于失活状态，将卵母细胞阻滞在期。本探讨对Cdh1基因在牛卵母细胞BD中的功能进行了探讨。本探讨首先以牛颗粒细胞中克隆了Cdh1基因并构建了pVenus-Cdh1重组质粒；其次对Roscovitine（ROS）抑制后的牛卵母细胞BD进程的变化进行了探讨；最后，通过向牛卵母细胞中显微注射Cdh1-Venus cRNA，对Cdh1蛋白在牛卵母细胞中的定位情况进行了观察，并探讨了超表达Cdh1基因对牛卵母细胞BD的影响。探讨取得以下结果：1.利用RT-PCR技术成功地以牛颗粒细胞中克隆得到Cdh1基因的CDS全长序列，经与NCBI上公布的Cdh1序列进行比对，同源性为100%。将其连接到pVenus真核表达载体上成功构建了pVenus-Cdh1重组质粒。2.将牛卵母细胞在含有50μM ROS的成熟培养液中培养14h，然后移入不含ROS的成熟培养液中，分别在之后的0h、1h、2h、3h和4h将卵母细胞固定。对照组卵母细胞在不含ROS的成熟培养液中培养，分别在0h、2h、4h、6h和8h将卵母细胞固定。对卵母细胞进行染色，然后判定卵母细胞所处的时期，并统计BD发生率。结果发现与对照组相比，ROS抑制后的牛卵母细胞BD进程缩短了大约4h。3.向ROS抑制的牛卵母细胞中显微注射Cdh1-Venus cRNA，对不同时期牛卵母细胞中Cdh1-Venus蛋白的定位情况进行了观察。结果显示，在期牛卵母细胞中，Cdh1-Venus蛋白主要分布于生发泡中，BD发生后，Cdh1-Venus蛋白主要分布在染色体和纺锤体所在的区域。4.向对照组和实验组的牛卵母细胞中分别注射Venus cRNA和Cdh1-Venus cRNA，分别在移除ROS后的1h、2h和3h将卵母细胞固定并染色，后然判定卵母细胞所处的时期并统计期卵母细胞的比例。结果显示，实验组中期卵母细胞的比例均高于对照组，并且在2h和3h时分别有着显著性差别，说明在牛卵母细胞中超表达Cdh1基因延迟了BD的发生。本探讨得到如下结论：ROS抑制后的牛卵母细胞BD进程缩短了大约4h；在期牛卵母细胞中，Cdh1蛋白主要分布于生发泡中，BD发生后，Cdh1蛋白主要分布于染色体和纺锤体所在的区域；在牛卵母细胞中超表达Cdh1基因延迟了BD的发生。关键词：Cdh1论文BD论文牛论文卵母细胞论文Roscovitine论文
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ABSTRACT8-12
第一部分：文献综述12-18
第一章 Cdh1 基因在卵母细胞减数分裂调控中的作用12-18

1.1 Cdh112

1.2 APC/C12-13

1.3 MPF13

1.4 卵母细胞期阻滞和恢复13-16

1.4.1 cAMP14

1.4.2 CDK1 活性的调控14-15

1.4.3 PKA15-16

1.5 APCCdh1依赖性的 CycpnB1 水平的调控16

1.6 Cdh1 在前中期Ⅰ中的作用16-18

第二部分：试验探讨18-35
第二章 pVenus-Cdh1 重组质粒的构建18-23

2.1 材料策略18-19

2.

1.1 仪器设备18

2.

1.2 材料和试剂18

2.

1.3 RT-PCR 扩增牛 Cdh1 基因18-19

2.

1.4 pVenus-Cdh1 重组质粒的构建19

2.

1.5 pVenus-Cdh1 重组质粒转染 Hela 细胞19

2.

1.6 体外转录获得 Cdh1-Venus cRNA19

2.2 试验结果19-22

2.1 牛 Cdh1 基因扩增及序列浅析19-20

2.2 pVenus-Cdh1 重组质粒的构建20

2.3 pVenus-Cdh1 重组质粒转染 Hela 细胞20-21

2.4 体外转录获得 Cdh1-Venus cRNA21-22

2.3 讨论22

2.4 小结22-23

第三章 ROS 抑制后对牛卵母细胞 BD 进程影响的探讨23-27

3.1 材料策略23-25

3.

1.1 仪器设备23

3.

1.2 主要试剂及成熟液配制23-24

3.

1.3 牛卵母细胞的采集24

3.

1.4 ROS 对牛卵母细胞的抑制24

3.

1.5 牛卵母细胞的免疫荧光染色24-25

3.

1.6 数据浅析25

3.2 实验结果25-26

3.3 讨论26

3.4 小结26-27

第四章 Cdh1 蛋白在牛卵母细胞内的定位情况的探讨27-31

4.1 材料策略27

4.

1.1 仪器设备27

4.

1.2 主要试剂27

4.

1.3 实验策略27

4.2 实验结果27-29

4.3 讨论29

4.4 小结29-31

第五章 超表达 Cdh1 基因对牛卵母细胞 BD 影响的探讨31-35

5.1 材料策略31

5.

1.1 仪器设备和主要试剂31

5.

1.2 实验策略31

5.

1.3 数据浅析31

5.2 实验结果31-32

5.3 讨论32-34

5.4 小结34-35

结论35-36
参考文献36-42
致谢42-43
作者介绍43