探讨受体镁离子抑制表达在爪蟾卵母细胞上P2X_4受体介导ATP-激活电流：疼痛治疗新靶点？工作

论文导读：
摘要：目的：探讨镁离子对大鼠P2X_4受体介导的ATP-激活电流(ATP-activated current, I_(ATP))的调制及作用位点。策略：运用基因定点突变技术将大鼠P2X_4受体Asp280分别突变成谷氨酰胺、谷氨酸或者使Asp280缺失。将野生型和突变型P2X_4受体的cDNA在体外转录成cRNA，并通过显微注射技术，将cRNA注入去滤泡膜的爪蟾卵母细胞中进行表达，用双电极电压钳技术记录细胞外液镁离子对I_(ATP)的影响。结果：(1)在注入了P2X_4受体cRNA的爪蟾卵母细胞外加ATP，可诱发I_(ATP)；(2) PPADS和suramin对I_(ATP)无显著性影响；(3)0.5~10mmol/L的镁离子抑制I_(ATP)，且具有浓度依赖性及可逆性，半效抑制浓度(IC50)为(1.24±0.07) mmol/L，胞外的镁离子被冲洗后，I_(ATP)可恢复到对照值；(4)1mmol/L的镁离子使IATP量-效曲线右下移，半数有效浓度(EC50)无显著性转变，但最大效应电流(Emax)减小；(5)镁离子时间依赖性地抑制I_(ATP)，用镁离子预先孵育卵母细胞80s后再加ATP，对P2X_4受体介导的I_(ATP)抑制效应达最大；(6)膜电位的转变不影响镁离子对I_(ATP)的抑制效应；(7) P2X_4受体Asp280被突变成不带电荷的谷氨酰胺后，100μmol/L ATP诱发的IATP幅值和相同浓度的ATP诱发野生型P2X_4受体介导的I_(ATP)幅值相比显著降低，仅为对照值的(4.12±0.15)%；将Asp280突变成带负电荷的谷氨酸后，I_(ATP)幅值和对照值相比无显著性差别；(8)当Asp280缺失后，100μmol/LATP诱发的I_(ATP)显著增大，胞外加0.5~10mmol/L的镁离子对相应的IATP无显著性影响。结论：(1)镁离子可能通过作用于P2X_4受体Asp280而抑制P2X_4受体介导的I_(ATP)；(2)镁离子抑制P2X_4受体介导的I_(ATP)可能是镁离子治疗疼痛的机制之一。目的：探讨酒精对大鼠颈上神经节P2X_4受体介导的ATP-激活电流(ATP-activated current,I_(ATP))的调制及机理。策略：将大鼠颈上神经节P2X_4受体表达在非洲爪蟾卵母细胞中，运用双电极电压钳技术记录P2X_4受体介导的I_(ATP)及酒精对I_(ATP)的影响。结果：(1)1~500mmol/L的酒精抑制P2X_4受体介导的ATP-激活电流，随着酒精浓度的增加，对I_(ATP)的抑制作用越显著。这种抑制效用是可逆的，当细胞外的酒精被冲洗后，I_(ATP)可恢复到对照值；(2)60mmol/L的酒精使P2X_4受体介导的I_(ATP)量-效曲线平行右移，最大电流(Emax)不变，半数有效浓度(EC50)增大，浓度大于500mmol/L的酒精不能使EC50继续增大；(3)酒精对ATP-激活电流的抑制不具有电压依赖性，且不转变翻转电位；(4)1mmol/L的镁离子和10mmol/L的酒精分别能抑制10μmol/L ATP诱发的电流，抑制率分别为(39±3.8)%和(19±1.6)%，当两者同时加入时(两者的终浓度不转变)对ATP-激活电流的抑制呈现叠加效应。结论：(1)酒精对表达在非洲爪蟾卵母细胞上大鼠颈上神经节P2X_4受体介导的I_(ATP)具有抑制效应，这种抑制效应具有浓度依赖性、可逆性，无电压依赖性，可能是酒精通过对P2X_4受体的变构调节实现的；(2)酒精和镁离子在P2X_4受体胞外环上可能具有不同的调制位点。关键词：镁离子论文P2X_4受体论文爪蟾卵母细胞论文定点突变技术论文双极电压钳技术论文酒精论文镁离子论文P2X_4受体论文爪蟾卵母细胞论文双电极电压钳技术论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。第一部分 镁离子抑制表达在爪蟾卵母细胞上P2X4受体介导的ATP-激活电流：疼痛治疗的新靶点？4-5
摘要4-5
第二部分 酒精抑制大鼠颈上神经节 P2X4受体介导的 ATP-激活论文导读：纯化17-182.6P2X_4受体cDNA的体外转录182.7转录产物的纯化18-193结果19-223.1提取的质粒及质粒被单酶切后的电泳图19-203.2突变后质粒酶切鉴定20-213.3线性化质粒纯化后及cDNA转录成cRNA的电泳图21-22二P2X_4受体异体表达模型的建立22-321材料22-23

1.1实验动物222实验药品及器材223实验所用的溶液及配制

电流5-6
摘要5-6
Part Ⅰ Mg2+Inhibites ATP-Activated Current Mediated by P2X4Receptors Expressed in Xenopus Oocytes: New Target for Pain?6-8
Abstract6-8
Part Ⅱ Ethanol Inhibits ATP-Activated Current Mediated by Rat P2X4Receptors8-12
Abstract8-12
第一部分 镁离子抑制表达在爪蟾卵母细胞上 P2X_4受体介导的 ATP-激活电流：疼痛治疗的新靶点？12-35
前言12-14

一、大鼠野生型及突变型 P2X_4受体 cRNA 的制备14-22

1 材料14-15

1.1 重组质粒14

1.2 实验药品及试剂盒14-15

1.3 实验仪器及设备15

2 策略15-19

2.1 氯化钙法制备感受态细菌15

2.2 质粒的转化及筛选15-16

2.3 质粒提取16

2.4 P2X_4受体定点突变16-17

2.5 质粒酶切及纯化17-18

2.6 P2X_4受体 cDNA 的体外转录18

2.7 转录产物的纯化18-19

3 结果19-22

3.1 提取的质粒及质粒被单酶切后的电泳图19-20

3.2 突变后质粒酶切鉴定20-21

3.3 线性化质粒纯化后及 cDNA 转录成 cRNA 的电泳图21-22

二、P2X_4受体异体表达模型的建立22-32

1 材料22-23

1.1 实验动物22

1.2 实验药品及器材22

1.3 实验所用的溶液及配制22

1.4 实验仪器及设备22-23

2 策略23-24

2.1 卵母细胞的获取23

2.2 cRNA 的显微注射和卵母细胞的培养23

2.3 P2X_4受体介导的 ATP-激活电流的记录23

2.4 电流结果浅析23-24

3 结果24-29

3.1 爪蟾卵母细胞表达的 P2X_4受体介导的 ATP-激活电流24

3.2 P2X 受体抑制剂 PPADS 及 suramin 对 IATP的影响24-25

3.3 不同浓度的镁离子对 IATP的调制25-26

3.4 镁离子对 IATP量-效曲线的影响26

3.5 镁离子孵育时间对 IATP的影响26-27

3.6 镁离子对 IATP的抑制与钳制电位的联系27-28

3.7 镁离子对 P2X_4受体突变体介导的 IATP的调制28-29

4 讨论29-32
参考文献32-35
第二部分 酒精抑制大鼠颈上神经节 P2X_4受体介导的 ATP-激活电流35-44
前言35-36
1 材料36

1.1 实验动物及质粒36

1.2 实验药品及溶液36

2 策略36-37

2.1 P2X_4受体 cRNA 体外制备36

2.2 P2X_4受体的表达36

2.3 电生理记录及数据浅析36-37

3 结果37-41

3.1 10 μmol/L 的 ATP 诱发的电流37

3.2 胞外不同浓度的酒精对 P2X_4受体介导的 IATP的影响37-38

3.3 60 mmol/L 酒精对 P2X_4受体介导的 IATP量-效曲线的影响38-39

3.4 酒精对 P2X_4受体介导的 IATP的抑制与膜电位的联系39-40

3.5 酒精对 IATP翻转电位的影响40

3.6 镁离子和酒精对 P2X_4受体介导的 IATP的影响40-41

4 讨论41-43
参考文献43-44
综述 ATP/P2X 在神经病理性疼痛中的探讨进展44-53
参考文献50-53
致谢53-54
[附录] 探讨生期间公开发表的文章54