简论LINE-15非编码序列（5-UTR）在HepG2细胞中功能-

论文导读：酰化组蛋白的分布方式,二是可能通过与AG02蛋白之间的相互作用,影响了miRNA123下一页
摘要：目的：探讨LINE-1逆转座子非编码序列5'-UTR (5'-untranslated region)在肿瘤细胞中的作用机制。策略：采取常规分子克隆技术将不同长度的5’-UTR序列(400bp、680bp、全长903bp)构建到荧光素酶载体pCBG99-control上,然后将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中,通过荧光素酶报告基因的表达探讨其具有的双向启动子的活性,并通过构建不同长度的突变体比较其结构对活性的影响；基于我们的发现,我们浅析了启动子不同活性的结构基础,并对差别区域可能生成的：miRNA761进行了进一步探讨,通过共转染HepG2细胞,观察micro RNA761对报告基因荧光素酶的表达的影响。为进一步探讨LINE-1序列中的5'-UTR的作用机制以及可能与L1-ORFlp之间的联系,我们通过共同转染,检测转染细胞基因组中L1-5’UTR的化和组蛋白乙酰化的变化；另外,由于L1-ORFlp与RISC(RNA诱导沉默复合体)珍惜爱细胞中有共定位现象,我们推测L1-ORFlp可能与RISC中的重要组分有着相互作用,为此我们通过免疫共沉淀技术检测ORF-1p和AGO2蛋白之间是否形成蛋白复合体。结果：正向不同长度的5’-UTR序列均具有启动子的活性,且680bp的5’-UTR活性最大,与pCBG99-control报告基因表达载体中的SV40启动子活性相当,全长次之,400bp长度的活性最低；反向5’-UTR序列的启动子活性低于正向；重组载体和microRNA761共转染结果显示,micro RNA761在5’-UTR序列负反馈的调控中没有发挥作用。L1-ORFlp对5’-UTR序列有抑制作用,这种抑制作用不是通过基因组的化,而可能是通过影响乙酰化组蛋白的分布方式调控的,其作用机制需要进一步的探讨；另外,ORF-1p与AG02蛋白之间有着相互作用,以而可能对AG02的活性造成影响。结论：5’-UTR序列具有启动子活性,且不同长度的序列,其正义链启动子活性在保留其5‘端680bp时最强,提示5‘UTR全长在3’端有着对其活性抑制的区域,反义链启动子有一定的活性,强度约为正向启动子的八分之一。ORF-1p对LINE-1的5’-UTR的抑制是通过两种方式调控的,一是通过乙酰化组蛋白的分布方式,二是可能通过与AG02蛋白之间的相互作用,影响了miRNA论文导读：TR序列的启动子活性检测36-373.4.25'-UTR序列对相邻基因表达的影响37-403.4.3microRNA761对5'-UTR启上一页123下一页
或siRNA的加工生成。这些具体的机制还未见报道,对了解肿瘤发生、进展和调控的分子机理以及肿瘤药物靶标具有重要作用。关键词：UINE-1论文5’-UTR论文ORF1-p论文AGO-2论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。致谢5-6
中文摘要6-7
ABSTRACT7-10
1 引言10-16

1.1 背景与作用10-13

1.2 探讨对策13-16

1.2.1 探究正反向不同长度的5’-UTR序列的启动子活性13-14

1.2.2 L1-ORF1基因对LINE-1的抑制以及调控机制14-16

2 实验材料与策略16-32

2.1 实验材料16-20

2.

1.1 细胞与质粒载体16

2.

1.2 主要工具酶及试剂16

2.

1.3 主要溶液的配制16-18

2.

1.4 DNA合成和测序18-19

2.

1.5 microRNA761的序列19

2.

1.6 主要仪器19

2.

1.7 主要耗材19-20

2.2 实验策略20-32

2.1 细胞培养20

2.2 细胞基因组的提取20-21

2.3 全长目的基因的T载体的构建21-23

2.4 报告基因表达载体的构建23-25

2.5 转染级质粒的提取25

2.6 质粒转染25-26

2.7 荧光素酶的检测26-27

2.8 microRNA的转染27

2.9 Western Blot27-29

2.10 荧光定量PCR29-30

2.11 细胞培养中抑制化作用30

2.12 间接免疫荧光30-31

2.13 免疫共沉淀31-32

3 实验结果32-51

3.1 HepG2细胞基因组的提取32

3.2 全长目的基因的T载体的构建32-33

3.3 报告基因表达载体的构建33-36

3.1 目的基因片段的选择33-34

3.2 pCBG99-control真核表达载体构建示意图34-35

3.3 扩增目的片段35

3.4 重组质粒酶切鉴定35-36

3.4 萤光素酶表达强度检测36-42

3.4.1 正反向不同长度的5'-UTR序列的启动子活性检测36-37

3.4.2 5'-UTR序列对相邻基因表达的影响37-40

3.4.3 microRNA761对5'-UTR启论文导读：

动子活性的影响40-42

3.5 ORF1蛋白表达的Western Blot验证42-43

3.6 L1-ORF1p对5'-UTR化的影响43-47

3.7 L1-ORF1p对细胞核中组蛋白的影响47-49

3.8 ORF-1p和AG02蛋白的相互作用验证49-51

4 讨论51-54

4.1 正反向不同长度的5’-UTR序列的启动子活性51-52

4.2 microRNA761对LINE-1启动子活性影响的探讨52

4.3 L1-ORF1基因对LINE-1的抑制以及调控机制52-54

5 结论54-55
参考文献55-58
附录A58-59
作者简历59-61
学位论文数据集61