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阐释干细胞人表皮干细胞分离培养

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论文导读:hecellswereseededincultureflaskwhichwasdeal摘自:学术论文格式www.7ctime.comedwithtypeIVcollagen.Theepidermalstemcellswereidentifiedbyimmunocytochemicaltechniqueforthedetectionofintegrinβ1andCK19.Thecellcloneformationofepidermalstemcellsandkeratinocytewerec
【摘要】 目的 探索人表皮干细胞原代培养方法。方法 将皮肤标本进行分离, 用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后, 重悬细胞, 接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果 倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好, 表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞(P<0.05)。结论 采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。
【关键词】 表皮干细胞;培养;鉴定
Isolation and culture methods of human epidermal stem cells Tian Ya-ning, Zhou Zhihui, Liang Man, et al. Second Affiliated Hospital of Shanxi University of traditional Chinese medi cine, Xian yang 712000, China
【Abstract】 Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ, the cells were seeded in culture flask which was deal摘自:学术论文格式www.7ctime.com
ed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted, epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1 and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes (P<0.05).Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells.
【Key words】 Epidermal stem cell; Culture; Identification
表皮干细胞具有无限增殖的能力, 在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用,本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂 DMEM培养基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 单克隆抗体β1整合素, 单克隆抗体CK19, Ⅳ型胶原, DispaseⅡ酶, 胎牛血清(FBS), 表皮细胞生长因子, 0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)。
1. 2 实验设备 CO2恒温培养箱, 无菌超净工作台, 倒置相差显微镜, 普通光学显微镜。

1. 3 方法

1. 3. 1 原代培养 严格无菌操作, 切取5×5 mm2左右的皮肤标本, 标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮, 切取前分离皮下组织, 将分离得到的皮肤组织用含青-链霉素的PBS冲洗3次, 切成小皮块后置于含2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培养基中4℃过夜, 培养基中含有青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 μg/ml), 第二天分离表皮和真皮层, 收集表皮皮片, 37℃条件下0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化15 min, 胎牛血清终止消化, 轻轻吹打, 200目筛网过滤, 收集细胞悬液, 1000 rpm离论文导读:病的明显上升,外科手术对于皮肤组织的需求也相应增加,自体皮肤移植往往受到限制,组织工程皮肤的研发具有重要的临床应用价值。目前,构建理想的人工皮肤成为本领域研究的一大热点。由于表皮干细胞具有无限增殖的能力,因此,在人工皮肤的研究中具有重要作用。表皮干细胞的分离培养方法多样,用于鉴定表皮干细胞的标记物有
心5 min, 弃上清, 加入新鲜培养液(DMEM表皮干细胞完全培养液含10%的FBS, 10 μg/L 的表皮细胞生长因子, L-谷氨酰胺0.1 mM, 非必需氨基酸0.1 mM), 重悬细胞, 计数, 调整细胞浓度至5×105个/ml, 种植于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养(37℃, 5%CO2饱和湿度恒温培养箱), 培养瓶及培养板等均用Ⅳ型胶原预先铺好, 并用加有双抗的DMEM培养液轻轻清洗1次。每3天换1次液, 并在倒置显微镜下观察细胞生长状况及有无其他病原体污染, 对于未贴壁的细胞轻轻吸出作为角质细胞对照组加入相同的培养液进行培养。
1. 3. 2 传代培养 细胞长至80%融合以后, 经0.25%胰蛋白酶消化5 min左右, 终止消化, 用吸管轻轻吹打贴壁细胞, 收集细胞悬液, 1000 rpm离心5 min, 弃上清, 重悬细胞, 计数。按1:3比例进行传代, 于37℃ 5%CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。定期在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况, 根据生长状况进行换液。
1. 3. 3 免疫化学染色 细胞贴片, PBS洗涤, 4%多聚甲醛固定20 min, 采用SP法按照试剂的使用说明步骤进行β1整合素、CK19的免疫细胞化学染色检测, 滴加一抗、二抗后, DAB显色, 复染、脱水、透明、封片, 镜下观察。 1. 4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行数据处理和统计分析, 克隆形成数目用( x-±s)表示, 表皮干细胞与角质细胞克隆形成的比较采用配对t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
细胞生长状况良好, 贴壁率较高, 没有其他病原体的污染, 在倒置相差显微镜下观察贴壁的表皮干细胞, 呈圆形或多角形, 体积较小, 培养14 d左右形成较大克隆。经免疫细胞化学染色后, 表皮干细胞标记物β1整合素、CK19均呈阳性反应。
细胞克隆形成率测定:取第2代表皮干细胞及角质细胞, 分别制备单细胞悬液, 按200个细胞/孔的密度接种于6孔培养板中培养2周, 应用吉姆萨染色方法, 镜下观察细胞克隆形成情况并计数, 克隆形成率=细胞克隆数/接种细胞数×100%, 以角质细胞作对照。表皮干细胞与角质细胞克隆形成情况比较如表1所示。
应用SPSS17.0软件进行统计分析, 行配对t检验, t=9.88, P<0.05, 差异具有统计学意义, 即表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞。
3 讨论
随着烧伤、创伤等疾病的明显上升, 外科手术对于皮肤组织的需求也相应增加, 自体皮肤移植往往受到限制, 组织工程皮肤的研发具有重要的临床应用价值。目前, 构建理想的人工皮肤成为本领域研究的一大热点。由于表皮干细胞具有无限增殖的能力, 因此, 在人工皮肤的研究中具有重要作用。表皮干细胞的分离培养方法多样, 用于鉴定表皮干细胞的标记物有很多, 但某些标记分子缺乏特异性, 如何筛选特异性的标记分子来区分表皮干细胞显得尤为必要。
正常的皮肤分为表皮和真皮, 其中表皮分为5层, 由内向外依次为基底层、棘细胞层、颗粒细胞层、透明细胞层和角质细胞层。基底细胞位于表皮最内层的基底膜上, 而表皮干细胞则存在于表皮的基底层和毛囊的隆突部, 大多数情况下, 表皮干细胞处于静息状态, 在受到创伤或理化等因素刺激下可激活, 可增殖分化为表皮中各种细胞成分, 保持皮肤正常的表皮结构。由于表皮干细胞具有无限增殖的能力, 因此, 可用于组织工程皮肤的研究中。表皮干细胞的原代培养可采用胶原快速粘附, 可使表皮干细胞及时贴壁生长, 在培养过程中, 为防止病原体的污染, 可在组织分离过程以及完全培养液中加入青霉素及链霉素等。目前, 表皮干细胞的鉴定主要依据其表面特异性的标记分子, 研究表明:CD34可作为小鼠干细胞的表面标记, 而人的毛囊区也有CD34的表达。角蛋白14和15、 α6整合素[2, 3]、β1整合素[4]以及CK19[5]等均为表皮干细胞的标记分子。而表皮干细胞论文导读:.JClinInvest,2006,116(1):249-260.JonathanA,Nowak,ElaineFuchs.Isolationandcultureofepithelialstemcells.MethodsMolBiol,2009(482):215-232.JensenKB,DriskellRR,WattFM.Assayingproliferationanddifferentiationcapacityofstemcellsusingdisaggregatedadultmouseepid
的特异性标记物还有待进一步研究证实, 才能将其与其他角朊细胞区分开来。
参考文献
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