试论基因组多杀性巴氏杆菌全基因组测序与比较基因组学

论文导读：
摘要：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)是一种重要的多宿主病原菌,可引起猪萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis, AR)和猪肺疫(Swine pneumonia),是猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex, PRDC)的重要致病因子之一,同时还是禽霍乱(Fowl cholera)、牛和水牛、羊从及家兔等动物出血性败血病(Haemorrhagic septicaemia, HS)的病原菌。该类细菌广泛流行于世界各地,给养殖业造成了巨大的经济损失。多杀性巴氏杆菌已知的毒力因子(Virulence factor, VF)包括荚膜、脂多糖、毒素和外膜蛋白等,很多关键的毒力因子尤其是致病的特异性因子有待进一步挖掘。目前公布的仅两株多杀性巴氏杆菌全基因组序列限制了我们以全基因组水平解释Pm的致病特点。由此,为了更全面的探讨多杀性巴氏杆菌的遗传变异规律及致病因子,我们进行了多株多杀性巴氏杆菌全基因组测序与分析等探讨,具体内容如下：1.多杀性巴氏杆菌全基因组测序与分析我们应用Solexa办法对7株多杀性巴氏杆菌的全基因组序列进行了测定。经过拼接,获得了7株Pm基因组的草图序列,各序列的大小以2.22Mb到2.36Mb不等。我们选取了菌株HB03和HN06进行了基因组缺口的人工修补和注释,获得了2株Pm环状全基因组序列。HB03基因组大小为2,307,684bp,平均GC含量为40.4%,编码2,118个CDS,6个核糖体16s-23s-5s rRNA操纵子和53个tRNA (GenBank登录号：CP003328); HN06基因组大小为2,402,218bp,平均GC含量为40.2%,编码2,258个CDS,6个核糖体16s-23s-5s rRNA操纵子和56个tRNA (GenBank登录号：CP003313)。另外,HN06菌株中还包含1个大小为5,360bp的质粒pHN06(GenBank登录号：CP003314),其GC含量为47.5%,编码7个CDS。同时,对两株菌的假基因、噬菌体相关编码基因及双组份调控体系等基本特点进行了分析。2.多杀性巴氏杆菌全基因组水平核苷酸对比分析我们将本探讨中完整测序菌株HB03和HN06与GenBank数据库中已经公布的菌株Pm70(GenBank登录号：NC_002663)和36950(GenBank登录号：CP003022)的完整序列一起进行了全基因组共线性对比分析,发现多杀性巴氏杆菌基因组中有着插入缺失和重排现象。Pm70与其余3株相比,有着5个较大区域的倒位,另外3株Pm基因组的共线性较好。进一步从HB03为参考,分析了其余3株菌相对于HB03而言基因组中插入和缺失的基因组区域。4株菌之间非匹配区域的平均长度为226kb,占HB03基因组总长度的9.8%。HB03基因组中缺失和插入基因组区域的平均长度分别为6,704bp和7,117bp。HB03与其余3株菌相比,有着两个分别为37,342bp和18,757bp的特有基因组区域,分析推测,前者是以噬菌体整合而来,后者为四环素类耐药基因岛。同时分析了HN06基因组相对于HB03而言3个36kb从上的插入基因组区域,其中最大的区域编码62个CDS,是1个包含toxA毒力基因的前噬菌体序列。根据功能注释推测,另外两个基因组区域也以噬菌体水平转移而来。对比发现,这三个基因组区域在Pm70和36950中也不有着,为HN06基因组特有区域。3.多杀性巴氏杆菌基因组水平的蛋白质成分对比分析应用两种办法对比分析了4株多杀性巴氏杆菌蛋白质编码基因的分布,1812个HB03蛋白质基因在4个Pm基因组中高度保守,79个HB03蛋白质基因在其余3个Pm基因组中具有明显的遗传多样性。4株多杀性巴氏杆菌的总基因簇为2,687个,其中核心基因簇数为1,789个,占总基因簇66.6%,至少在两株菌中分布的非核心基因簇的有261个,占总基因簇的9.7%；剩余的23.7%为各个菌株所特有的基因簇。分析同时只在两株菌有的基因簇发现,36950与HB03共有的基因簇(67个)显著多余其他组合。各个菌株特有的基因从HN06菌株最多,为297个。同时,挖掘了这些差别区域编码基因的生物学功能,展示了论文导读：氏杆菌基因组序列的测定26-273.2.4多杀性巴氏杆菌完整基因组注释与分析27-293.2.5多杀巴氏杆菌对比基因组学分析29-303.2.6多杀性巴氏杆菌基因组进化分析30-314结果与分析31-514.1所测多杀性巴氏杆菌的基本特点314.2所测多杀性巴氏杆菌基因组一般特点31-404.2.17株多杀性巴氏杆菌基因组拼接结果初步统计314.2.24株多
荚膜合成基因簇、脂多糖合成基因簇和Flp操纵子在4株菌之间的差别。4.多杀性巴氏杆菌基因组进化分析使用4株多杀性巴氏杆菌基因组之间45,871个SNP位点,串联后绘制了体系发育邻接树。4株菌分布在3个不同的分支,菌株HB03与36950的亲缘联系较近,而与HN06亲缘联系较远。这一结果与核苷酸水平和氨基酸水平分析结果相一致。关键词：多杀性巴氏杆菌论文基因组测序论文对比基因组论文毒力论文
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Abstract9-11
缩略词11-12
1 文献综述12-23

1.1 微生物基因组学12-15

1.1 微生物基因组学的探讨历史12

1.2 微生物基因组测序发展12-13

1.3 微生物基因组测序技术的进展13-14

1.4 微生物基因组学探讨的运用14-15

1.2 多杀性巴氏杆菌的探讨发展15-23

1.2.1 多杀性巴氏杆菌的生物学特性与分型15-16

1.2.2 多杀性巴氏杆菌的流行与危害16-17

1.2.3 多杀性巴氏杆菌毒力因子的探讨发展17-22

1.2.4 多杀性巴氏杆菌基因组学的探讨发展22-23

2 探讨的目的和作用23-24
3 材料和办法24-31

3.1 材料24-25

3.

1.1 菌株24

3.

1.2 主要工具酶及试剂24

3.

1.3 主要培养基的配制24-25

3.

1.4 主要仪器与设备25

3.2 办法25-31
3.

2.1 测序菌株的筛选25-26

3.

2.2 细菌全基因组的提取26

3.

2.3 多杀性巴氏杆菌基因组序列的测定26-27

3.

2.4 多杀性巴氏杆菌完整基因组注释与分析27-29

3.

2.5 多杀巴氏杆菌对比基因组学分析29-30

3.

2.6 多杀性巴氏杆菌基因组进化分析30-31

4 结果与分析31-51

4.1 所测多杀性巴氏杆菌的基本特点31

4.2 所测多杀性巴氏杆菌基因组一般特点31-40

4.

2.1 7株多杀性巴氏杆菌基因组拼接结果初步统计31

4.

2.2 4株多杀性巴氏杆菌全基因组基本特点31-34

4.

2.3 假基因的分析34

4.

2.4 噬菌体相关编码基因34-39

4.

2.5 双组份调控体系39-40

4.3 4 株多杀性巴氏杆菌对比基因组学分析40-46
4.

3.1 核苷酸水平的对比分析40-44

4.

3.2 氨基酸水平的对比分析44-46

4.4 4 株多杀性巴氏杆菌基因组局部区域对比分析46-50

4.5 4 株多杀性巴氏杆菌基因组进化分析50-51

5 讨论51-54

5.1 测序菌株的筛选与基因组测序51

5.2 基因组学与对比基因组学分析51-52

5.3 局部区域对比分析52-53

5.4 下一步工作展望53-54

6 结论54-55
参考文献55-65
附录65-66
致谢66-67
附表67-75