探讨蛋白殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因克隆及重组蛋白表达学术

论文导读：
摘要：殊异韦荣菌(Veillonella dispar)是口腔中常见的一种球菌，其具有专性厌氧从及生长缓慢的特征，其在口腔菌斑pH调节从及龋病的发生等方面都存在重要意义。电子传递黄素蛋白是一类从黄素腺嘌呤二核苷酸(FlinAdenine Dinucleotide,FAD)为辅酶的蛋白，参与细胞的电子传递及pH调节。本实验从殊异韦荣菌为探讨对象，对其电子传递黄素蛋白基因(Electron Traner Floprotein,etf)进行克隆及表达，为将来龋病防治提供论述基础。本实验第一部分提取殊异韦荣菌基因组，通过PCR反应扩增etf基因序列，并与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后，进行测序验证。PCR产物特异大小约900bp。测序结果经Blast软件分析该序列为etf基因，通过基因序列及氨基酸的分析证明其具有完整的阅读框架，该基因序列已登录GenBank，序列号为JQ669939。第二部分构建etf-pET28a-c(+)重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达，从及表达条件的优化。etf-pET28a-c(+)重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，蛋白大小约33KD，设定七个诱导剂浓度梯度、七个诱导时间梯度成功摸索出etf-pET28a-c(+)重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达的最佳诱导条件为0.2mM IPTG诱导3小时，并通过超声裂解鉴定表达形式为包涵体，进行了重组蛋白的高效表达。本实验成功克隆了殊异韦荣菌的etf基因序列，通过基因序列及氨基酸的分析证明其具有完整的阅读框架，并进行了重组质粒的构建及最适表达条件的摸索，鉴定蛋白表达形式为包涵体，希望通过对其的探讨能够为后续蛋白功能探讨提供论述基础并为龋病防治探寻新途径。关键词：殊异韦荣菌论文电子传递黄素蛋白论文基因克隆论文重组蛋白表达论文
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Abstract7-9
英文缩略词表9-11
前言11-14
实验

一、殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因的克隆及检测14-26

1 材料14-15

1.1 菌种与质粒14

1.2 主要试剂14-15

1.3 主要仪器15

2 办法15-21

2.1 殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因的 PCR 克隆15-17

2.2 PCR 克隆产物的回收及鉴定17-21

3 结果21-24

3.1 殊异韦荣菌 etf 基因 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测21

3.2 殊异韦荣菌 etf-pMD18-T 克隆质粒酶切鉴定21-22

3.3 殊异韦荣菌 etf-pMD18-T 克隆质粒测序鉴定22-24

4 讨论24-26

4.1 获得目的基因的手段及办法24

4.2 殊异韦荣菌 etf 基因测序鉴定及同源性分析24-26

实验

二、殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因的重组蛋白表达26-41

1 材料26-27

1.1 菌种与质粒26-27

1.2 主要仪器和试剂27

2 办法27-33

2.1 etf-pET28a-c(+)重组质粒的构建27-28

2.2 etf-pET28a-c(+)重组质粒表达28-33

3 结果33-38

3.1 殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因 PCR 产物电泳检测33

3.2 etf-pET28a-c(+)重组质粒的鉴定33-35

3.3 etf-pET28a-c(+)在 BL21（DE3）中诱导表达的条件的优化35-37
3.4 etf-pET28a-c(+)在 BL21（DE3）中的高效表达及表达形式鉴定37-38
4 讨论38-41
4.1 etf-pET28a-c(+)在大肠杆菌 BL21（DE3）中的诱导表达条件的优化38-39
4.2 etf-pET28a-c(+)在大肠杆菌 BL21（DE3）中的高效表达及表达形式鉴定39-41
结论41-42
参考文献42-46
附录一46-47
附录二47-49
攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果49-50
致谢50