研讨乌贼曼氏无针乌贼SCD基因克隆与生物信息学怎样

论文导读：
摘要：硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoy-coenzymeAdesaturase，SCD）是脂肪酸去饱和化的关键酶，与作为体内能量重要来源和膜的重要组成成份的多不饱和脂肪酸(PUFA)共同维持膜流动性，并在脂肪酸代谢中起中心调节意义。本论文从曼氏无针乌贼(Sepiell amaindroni）为实验材料，采取RT-PCR和RACE技术克隆了曼氏无针乌贼SCD cDNA的全序列，并通过各种生物信息学软件对SCD基因的核酸和蛋白质序列进行分析。结果表明：SCD序列全长为1513bp，由261bp的5′非翻译区和331bp的3′非翻译区及可编码306个氨基酸的921bp开放阅读框组成。通过NCBI中Blastn分析发现，曼氏无针乌贼SCD核酸序列与真蛸相似性达到76%；进一步从ClustalX软件将曼氏无针乌贼的SCD基因与其他已发现SCD基因进行比对，发现SCD与真蛸和长牡蛎相似性达到91%，说明SCD在软体动物中的结构相对保守，与其他非软体动物SCD氨基酸同源性比对也体现为50%从上的相似性，说明SCD分子在进化分类上对比古老，可能是由同一祖先进化而来。分析不同物种SCD基因的体系进化树可知，曼氏无针乌贼和真蛸及牡蛎进化联系最近，与鱼类稍远，与人及大鼠等哺乳动物亲缘联系最远。TMHMM Server v.2.0在线软件预测SCD基因含有四个跨膜区域，在第50-100和200-250氨基酸处各含有两个跨膜区，说明SCD蛋白为典型的跨膜蛋白质；SignalP4.0在线工具预测SCD前体蛋白不含有信号肽位点，通过PSORTⅡ软件推测目的蛋白最可能的功能区域为内质网；通过ProtParam、ProtScale和PredictProtein在线服务软件对SCD蛋白进行预测分析可知，其论述分子量为34922.4Da，论述等电点为8.95，其中丙氨酸和亮氨酸的含量较高，分别达到了7.5%和10.5%，该蛋白机型按极速成分显著高于非机械性氨基酸成分因而提示为碱性蛋白的可能性较大， etPhos分析SCD有着7个潜在的磷酸化位点；SCD含有丰富的螺旋结构，其中45.10%为螺旋，9.48%的延伸链和45.52%的无规则卷曲。曼氏无针乌贼SCD基因的成功克隆及相关分析，对于深入研究软体动物脂肪酸代谢相关基因在生物体内意义机制及调控机理具有重要作用，进而在分子水平上为曼氏无针乌贼的良种培育及人工养殖提供科学依据。关键词：曼氏无针乌贼论文SCD基因论文cDNA论文生物信息学论文
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ABSTRACT9-14
第一章 文献综述14-24

1.1 曼氏无针乌贼的相关探讨14-15

1.1 曼氏无针乌贼生物学特性14

1.2 曼氏无针乌贼资源探讨14

1.3 曼氏无针乌贼繁殖习性探讨14

1.4 曼氏无针乌贼分子生物学探讨14-15

1.2 SCD 基因的探讨发展15-18

1.2.1 SCD1 的化学结构与种类15-16

1.2.2 SCD 基因的功能16-18

1.3 多不饱和脂肪酸探讨发展18-20

1.3.1 ω-3 和ω-6 脂肪酸18

1.3.2 共轭脂肪酸18

1.3.3 多不饱和脂肪酸的来源18

1.3.4 多不饱和脂肪酸的功能18-20

1.4 饱和脂肪酸的探讨发展20

1.5 生物信息学探讨发展20-24

1.5.1 生物信息学20-21

1.5.2 生物信息数据库21

1.5.3 生物信息学在基因克隆中的运用21

1.5.4 生物信息学在序列分析中的运用21-22

1.5.5 蛋白质结构和功能分析22-24

第二章 绪论24-27

2.1 探讨的目的与作用24-25

2.2 探讨内容与技术路线25-27

2.1 探讨内容25

2.2 主要探讨办法与路线25-27

第三章 曼氏无针乌贼 SCD 基因克隆与生物信息学分析27-57

3.1 材料，仪器与试剂配制办法27-29

3.

1.1 实验动物、载体和菌种27

3.

1.1 实验动物27

3.

1.2 载体与菌株27

3.

1.2 主要试剂及配制办法27-28

3.

1.3 主要仪器与设备28-29

3.2 实验办法29-3论文导读：
9
3.

2.1 总 RNA 的提取29-31

3.2.

1.1 实验器具的处理29

3.2.

1.2 总 RNA 提取步骤29-30

3.2.

1.3 总 RNA 质量鉴定30-31

3.2.

1.3.1 吸光度检测30

3.2.

1.3.2 电泳检测30-31

3.2.2 用于 PCR 扩增的第一链 cDNA 合成31
3.

2.3 引物设计与合成31-32

3.

2.4 曼氏无针乌贼 SCD 基因全长 cDNA 序列的扩增32-38

3.

2.4.1 曼氏无针乌贼 SCD 基因核心片段的克隆32-33

3.

2.4.2 曼氏无针乌贼 SCD 基因 5′端 cDNA 扩增33-34

3.

2.4.3 曼氏无针乌贼 SCD 基因 3′端 cDNA 扩增34-35

3.

2.4.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳纯化35-36

3.

2.4.5 PCR 产物的克隆36-38

3.

2.4.5.1 制平板36

3.

2.4.5.2 体会态细胞的制备36

3.

2.4.5.3 连接反应36-37

3.

2.4.5.4 转化培养37

3.

2.4.5.5 PCR 鉴定及测序37-38

3.

2.5 生物信息学分析38-39

3.

2.5.1 开放阅读框分析38

3.

2.5.2 同源性分析38

3.

2.5.3 多序列比对及分子进化分析38-39

3.3 结果与分析39-50

3.1 总 RNA 的提取39

3.2 RT-PCR 扩增结果39-40

3. 5′RACE 和 3′RACE 结果40

3.4. 曼氏无针乌贼 SCD 基因的全长 cDNA 序列40-41

3.5. 生物信息学分析41-50

3.5.1 开放阅读框分析41-42

3.5.2 核苷酸序列同源性分析42-43

3.5.3 SCD 氨基酸序列的同源性分析43

3.5.4 跨膜螺旋和信号肽分析43-44

3.5.5 亚细胞定位分析44-45

3.5.6 SCD 蛋白性质预测结果45-47

3.5.7 SCD 蛋白二级结构预测结果47

3.5.8 蛋白结构功能位点分析47-48

3.5.9 SCD 结构48-49

3.5.10 体系发育分析49-50

3.4 讨论50-57

3.4.1 曼氏无针乌贼总 RNA 的提取50

3.4.2 PCR 扩增引物的设计及反应条件的优化50-53

3.4.3 曼氏无针乌贼 SCD 蛋白的同源性分析53

3.4.4 跨膜螺旋和信号肽及亲疏水性分析53-56

3.4.5 SCD 蛋白质性质分析56-57

第四章 结论57-58
参考文献58-62
致谢62-63
在读期间发表的学术论文及探讨成果63