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简论琥珀酸大肠杆菌木糖生物合成琥珀酸代谢工程

最后更新时间:2024-03-05 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:29772 浏览:133742
论文导读:
摘要:琥珀酸在医药、食品、化学等领域的运用十分广泛,潜在的市场需求量巨大。但是传统的石化法生产琥珀酸不但耗费大量非可再生资源,如石油等,而且生产历程污染环境。由此,需要探究一种生产琥珀酸的清洁办法。为了达到此目的,人们探究了从碳水化合物为碳源,使用微生物发酵法生产琥珀酸。目前,发酵法生产琥珀酸的探讨已经有了初步进展,但是大多数的探讨都是从葡萄糖为碳源,而对其他碳源的探讨尤其是关于大肠杆菌使用木糖好氧发酵生产琥珀酸的报道较少。本文探讨大肠杆菌从木糖为碳源生产琥珀酸的办法,实现了不与人类争粮的资源战略思想,由此该办法具有潜在的市场前景。本实验目的是构建出木糖发酵生产琥珀酸的工程菌,为从木糖为原料发酵法生产琥珀酸做出实验室阶段的探究。本论文使用途经分析的办法,从木糖为唯一碳源对大肠杆菌生物合成琥珀酸的代谢途径进行探讨。根据途径分析的结果从大肠杆菌原始菌株BL21为出发菌株,使用一步敲除的办法进行菌种构建,使用PCR技术及琼脂糖凝胶电泳等办法验证基因是否敲除。将所构建的菌种进行摇瓶发酵,发酵结束后用HPLC对发酵液中的产物进行测定。通过本探讨得出从下结论:(1)使用对细胞代谢结构的理解和基因组信息,建立了有氧条件下E.cop使用木糖生物合成琥珀酸的代谢途径模型。(2)对木糖生物合成琥珀酸的代谢途径进行了途径分析,确定了木糖生物合成琥珀酸的最佳代谢途径,计算最大论述转化率为0.83mol/mol木糖,确定了代谢途径改造对策,明确需要敲除的基因和需要过量表达的基因。(3)根据途径分析的结果,使用P1噬菌体一步敲除的办法敲除了大肠杆菌BL21菌株琥珀酸脱氢酶(SDH),磷酸转乙酰基酶(Pta),丙酮酸脱氢酶(PoxB)基因,构建基因工程菌ZXY542;敲除大肠杆菌BL21菌株琥珀酸脱氢酶(SDH),磷酸转乙酰基酶(Pta),丙酮酸脱氢酶(PoxB),异柠檬酸裂解酶阻遏物(IclR)基因,构建基因工程菌ZXY412;敲除大肠杆菌BL21菌株琥珀酸脱氢酶(SDH),磷酸转乙酰基酶(Pta),丙酮酸脱氢酶(PoxB),乙酸激酶(Ack)基因,构建基因工程菌ZXY354612。(4)根据途径分析的结果,过量表达大肠杆菌MG1655菌株磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,获得木糖生物合成琥珀酸的基因工程菌ZXY412-JL225-9,基因工程菌ZXY542-JL225-9,基因工程菌ZXY354612-JL225-9。(5)摇瓶发酵结果表明所构建的菌株都能够在好氧条件下使用木糖生物合成琥珀酸。关键词:大肠杆菌论文琥珀酸论文木糖论文基因敲除论文异柠檬酸裂解酶阻遏物(IclR)论文丙酮酸脱氢酶(PoxB)论文琥珀酸脱氢酶(SDH)论文磷酸转乙酰基酶(Pta)论文
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Abstract6-12
第1章 绪论12-26

1.1 选题的目的和作用12-15

1.2 琥珀酸的运用15-18

1.2.1 琥珀酸在化学品领域的运用15-16

1.2.2 琥珀酸在食品领域方面的运用16-17

1.2.3 琥珀酸在医药卫生领域的运用17

1.2.4 琥珀酸在农业上的运用17-18

1.2.5 琥珀酸的其他运用领域18

1.3 发酵法生产琥珀酸的探讨近况18-22

1.3.1 产琥珀酸的微生物种类18-21

1.3.2 好氧发酵生产琥珀酸工程菌株的构建21-22

1.4 途经分析22-23

1.5 琥珀酸发酵生产工艺极为产品市场23-26

第2章 有氧条件下大肠杆菌木糖生物合成琥珀酸的途径分析26-34

2.1 引言26

2.2 实验材料26-27

2.1 菌种26

2.2 药品26-27

2.3 培养基27

2.4 实验仪器27

2.3 实验办法27-28

2.3.1 途径分析27

2.3.2 摇瓶培养27

2.3.3 产物的测定27-28

2.4 结果与分析28-33

2.4.1 大肠杆菌 BL21 摇瓶发酵28

2.4.2 E.cop 木糖生物合成琥珀酸的途径分析28-33

2.5 本章小结33-34

第3章 基因缺失菌株的构建34-64

3.1 实验材料34-37

3.1.1 菌种及质粒34-3论文导读:8-805.4.5讨论80-815.5本章小结81-82第6章结论与展望82-846.1结论82-836.2展望83-84参考文献84-92附录92-94攻读学位期间所取得的科研成果94-96致谢96上一页12
5
3.

1.2 主要设备35

3.

1.3 培养基35-36

3.

1.4 溶液的配制36

3.

1.5 引物36-37

3.2 实验办法37-45
3.

2.1 原始噬菌体的制备37

3.

2.2 质粒提取37-38

3.

2.3 poxB 基因的敲除38-41

3.

2.4 sdhA 基因的敲除41

3.

2.5 sdhB 基因的敲除41-42

3.

2.6 pta 基因的敲除42-43

3.

2.7 iclR 基因的敲除43-44

3.

2.8 ack 基因的敲除44-45

3.

2.9 琼脂糖凝胶电泳45

3.3 结果与分析45-62

3.1 poxB 基因的敲除45-48

3.2 sdhA 基因的敲除48-51

3.3 sdhB 基因的敲除51-54

3.4 pta 基因的敲除54-57

3.5 iclR 基因的敲除57-59

3.6 ack 基因的敲除59-62

3.4 讨论62-63

3.5 本章小结63-64

第4章 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因质粒的构建64-74

4.1 引言64

4.2 实验材料64-66

4.

2.1 菌种和质粒64

4.

2.2 主要仪器64

4.

2.3 主要试剂64-65

4.

2.4 培养基65

4.

2.5 溶液的配制65-66

4.3 实验办法66-70
4.

3.1 DNA 提取66

4.

3.2 PCR66-68

4.

3.3 JL225-9 质粒的构建68-70

4.4 实验结果与讨论70-72

4.1 DNA 提取70

4.2 二次 PCR70-71

4.3 测序分析71

4.4 JL225-9 质粒的构建71

4.5 克隆及酶切检测71-72

4.6 讨论72

4.5 本章小结72-74

第5章 基因敲除和表达对琥珀酸发酵的影响74-82

5.1 引言74

5.2 实验材料74-75

5.

2.1 菌种74

5.

2.2 药品74-75

5.

2.3 实验仪器75

5.3 实验办法75-76
5.

3.1 测定标准曲线75-76

5.

3.2 琥珀酸等产物的 HPLC 测定76

5.4 实验结果与讨论76-81
5.

4.1 琥珀酸的标准曲线76

5.

4.2 乳酸的标准曲线76-77

5.

4.3 乙酸的标准曲线77-78

5.

4.4 摇瓶发酵结果78-80

5.

4.5 讨论80-81

5.5 本章小结81-82
第6章 结论与展望82-84

6.1 结论82-83

6.2 展望83-84

参考文献84-92
附录92-94
攻读学位期间所取得的科研成果94-96
致谢96