探讨病毒双生病毒卫星启动子鉴定及病毒卫星症状决定因子

论文导读：
摘要：双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒,已在多个国家和地区的经济作物上造成严重危害。越来越多的双生病毒被报道伴随有betasatelpte和alphasatelpte,所有的betasatelpte在其互补链上都编码一个保守的βC1ORF,而所有的alphasatelpte在其病毒链上都编码一个复制相关蛋白Rep。本论文通过农杆菌介导的瞬时和转基因表达的办法,对赛葵黄脉病毒伴随betasatelpte (Malvastrum yellow vein betasatelpte, MYVB)、中国番茄黄曲叶病毒伴随betasatelpte (Tomato yellow leaf curl China betasatelpte, TYLCCNB)从及烟草曲茎病毒伴随alphasatelpte (Tobacco curly shoot alphasatelpte, TbCSA)的启动子相继进行了鉴定,并初步探讨了卫星启动子对病毒复制和致病性的影响。通过荧光光度法对MYVB βC1基因上游全长非编码区(991nt)进行了分析,瞬时表达结果表明991nt的片段具有启动子活性,是花椰菜花叶病毒(Caupflower mosaic virus, CaMV)35S启动子活性的29%。使用缺失突变的办法在MYVB PCI基因上游390nt到418nt的位置鉴定了一个对启动子活性具有重要调控意义的5UTR Py-rich stretch元件,该元件的缺失使得βC1基因的启动子活性下降到CaMV35S启动子活性的11%。进一步构建了缺失5UTR Py-rich stretch的MYVB病毒侵染性克隆,从赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus, MYVV)为辅助病毒,将突变体和野生型卫星分子分别先后侵染本氏烟叶盘和接种植株,Southern blot结果表明5UTR Py-rich stretch的缺失使得卫星分子的积累量有显著下降,分别下降为野生型的61%和62%,但是对病毒诱导的症状表型没有明显影响。通过荧光光度法和组织化学法对TYLCCNB-Y25βC1基因上游全长非编码区(982nt)进行了分析,结果表明982nt的片段体现CaMV35S启动子活性的44%,并且驱动GUS基因在转基因普通烟草中组成型表达。将982nt的片段串联后,瞬时表达结果表明GUS荧光活性提升到CaMV35S启动子的59%左右。鉴于之前的报道显示TYLCCNB-βC1启动子为韧皮部特异性表达,我们的结果证实双生病毒伴随的同一个卫星分子的不同分离物的βC1启动子在表达活性和表达方式上可能有着差别。侵染性分析实验显示,从中国番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)为辅助病毒时,TYLCCNB-Y25在本氏烟、三生烟、心叶烟从及番茄等寄主上能够引起曲叶症状,而TYLCCNB-Y10除引起曲叶外还能引起耳突、黄脉及茎秆扭曲等症状。为了明确βC1启动子的表达方式是否与症状相关,通过overlap extension PCR的办法对上面陈述的两个卫星分子βC1基因上游的全长非编码区(即启动子区)及βC1基因上游约200nt的片段(简称为片段PP, part promoter)进行了互换,构建嵌合体卫星的侵染性克隆,与辅助病毒TYLCCNV共同接种本氏烟。结果表明,嵌合有TYLCCNB-Y25启动子的TYLCCNB-Y10重组卫星分子跟野生型TYLCCNB-Y10类似,在寄主上诱导产生耳突和茎秆扭曲的症状；而嵌合有TYLCCNB-Y10启动子的TYLCCNB-Y25重组卫星分子在寄主上却仅诱导曲叶的症状,与野生型TYLCCNB-Y25类似。同样,互换PP区段的嵌合体卫星几乎未对病毒诱导症状表型产生影响。从上结果说明TYLCCNV伴随不同卫星分子编码的pC1蛋白对症状诱导起决定性意义,启动子对症状差别影响较小。为了明确症状差别的较小决定因子,进一步使用overlap extension PCR的办法构建了βC1三个区段(C末端,M部分,N末端)的嵌合体卫星分子,分别构建嵌合体卫星侵染性克隆,从TYLCCNV为辅助病毒接种本氏烟,结果发现,嵌合有TYLCCNB-Y10βCl的C末端部论文导读：
分的TYLCCNB-Y25分子获得了诱导耳突和茎秆扭曲的能力,但耳突的数量和大小都有所减少或变小,说明TYLCCNB-Y10αCl的C末端部分是诱导耳突和茎秆扭曲等表型所必需,而pcl的其他区段也能影响症状诱导。使用GUS报告基因对TbCS A Rep基因翻译起始位点上游420nt的片段进行了瞬时和转基因表达分析,结果表明,420nt片段的平均相对GUS活性是CaMV35S启动子的18%,并且在转基因烟草中组成型表达。通过缺失突变的办法发现,5’端缺失的系列启动子表达载体体现高低不同的活性,其中215nt的片段具有基础启动子活性,227nt片段体现与420nt片段相一致的活性；而3’端缺失56nt的片段基本丧失了启动子活性。关键词：双生病毒论文卫星分子论文启动子论文赛葵黄脉病毒论文中国番茄黄曲叶病毒论文烟草曲茎病毒论文
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摘要8-10
Abstract10-13
目录13-17
1 文献综述17-41

1.1 启动子的类型17-19

1.1 组成型启动子17-18

1.2 组织或器官特异性启动子18

1.3 诱导型启动子18-19

1.2 启动子克隆及探讨办法19-22

1.2.1 启动子克隆办法19-20

1.2.1 基因组文库筛选法19

1.2.2 启动子探针质粒载体筛选启动子19-20

1.2.3 使用PCR技术克隆启动子20

1.2.2 启动子探讨办法20-22

1.2.2.1 生物信息学分析其功能基序20

1.2.2.2 实验分析办法20-21

1.2.2.3 常用报告基因21-22

1.3 双生病毒探讨近况22-33

1.3.1 病毒的基因组结构及功能22-27

1.3.1 Mastrevirus病毒22-23

1.3.2 Curtovirus病毒23

1.3.3 Topocuvirus病毒23-24

1.3.4 Begomovirus病毒24-26

1.3.5 其他属病毒26-27

1.3.2 双生病毒致病相关因子27-33

1.3.2.1 C227-29

1.3.2.2 29-30

1.3.2.3 BC130-31

1.3.2.4 BV131-32

1.3.2.5 βC132-33

1.4 双生病毒启动子探讨近况33-36

1.4.1 Mastrevirus病毒启动子33

1.4.2 Curtovirus病毒启动子33-34

1.4.3 Begomovirus病毒启动子34-36

1.4.3.1 启动子的鉴定34-35

1.4.3.2 启动子的调控35-36

1.5 Nanovirus病毒启动子36-38

1.6 双生病毒启动子的功能探讨38-39

1.7 立题依据39-41

2 赛葵黄脉病毒βC1启动子调控元件的分析41-59

2.1 材料与办法42-49

2.

1.1 材料42

2.

1.2 载体构建42-46

2.

1.2.1 启动子表达载体构建42-45

2.1.2.2 缺失5UTR Py-rich stretch的MYVB突变体侵染性克隆的构建45-46
2.

1.3 农杆菌介导的植物接种46-47

2.

1.4 GUS荧光活性分析47-48

2.

1.4.1 荧光光度测定47

2.

1.4.2 蛋白质含量测定47-48

2.

1.5 GFP活性分析48

2.

1.6 数据分析48

2.

1.7 病毒DNA的提取及Southern blot检测48-49

2.

1.8 叶盘复制试验49

2.

1.9 序列分析49

2.2 结果及分析49-56

2.1 启动子表达载体构建及序列分析49-51

2.2 使用瞬时表达办法分析启动子表达载体活性51-53

2.2.3 5UTR Py-rich stretch元件对βC1启动子活性和MYVB复制效率的调控意义53-56

2.3 讨论56-59

3 中国番茄黄曲叶病毒伴随betasatelpte启动子的鉴定及症状决定因子分析59-93

3.1 材料与办法60-69

3.

1.1 材料60

3.

1.2 载体构建60-67

3.

1.2.1 TYLCCNB-Y25启动子表达载体的构建60-62

3.1.2.2 TYLCCNB-Y10及TYLCCNB-论文导读：转基因植株的Northernblot检测693.2结果与分析69-883.2.1TYLCCNB-Y25启动子分析69-753.2.1.1启动子瞬时表达活性69-723.2.1.2转基因烟草中GUS活性分析72-753.2.2与TYLCCNV伴随卫星分子症状决定因子的定位75-883.2.2.1野生型卫星TYLCCNB-Y10和TYLCCNB-Y25诱导症状表型分析75-783.2.2.2嵌合体卫星诱导症状分析78-823.
Y25嵌合体卫星的构建62-66
3.1.2.3 TYLCCNB-Y10及TYLCCNB-Y25嵌合体卫星侵染性克隆的构建66
3.

1.2.4 TYLCCNB-Y25 βC1转基因表达载体的构建66-67

3.

1.3 烟草的转化67-68

3.

1.4 GUS荧光活性分析和组织化学染色68-69

3.

1.5 农杆菌介导的植物接种69

3.

1.6 病毒DNA的Southern blot检测69

3.

1.7 转基因植株的Northern blot检测69

3.2 结果与分析69-88
3.

2.1 TYLCCNB-Y25启动子分析69-75

3.2.

1.1 启动子瞬时表达活性69-72

3.2.

1.2 转基因烟草中GUS活性分析72-75

3.2.2 与TYLCCNV伴随卫星分子症状决定因子的定位75-88
3.2.2.1 野生型卫星TYLCCNB-Y10和TYLCCNB-Y25诱导症状表型分析75-78
3.

2.2 嵌合体卫星诱导症状分析78-82

3.

2.3 表达TYLCCNB-Y25 βC1转基因植株的症状82-84

3.

2.4 症状较小决定因子定位84-88

3.3 讨论88-93

3.1 启动子分析88-90

3.2 症状决定因子的定位90-93

4 烟草曲茎病毒伴随alphasatelpte启动子的鉴定和分析93-105

4.1 材料与办法93-96

4.

1.1 病毒材料93

4.

1.2 载体构建93-95

4.

1.3 瞬时表达95

4.

1.4 GUS及GFP荧光活性分析95-96

4.

1.5 烟草转化96

4.

1.6 GUS活性的组织化学染色96

4.

1.7 Real time PCR检测GUS基因的表达量96

4.2 结果与分析96-103
4.

2.1 TbCSA Rep全长启动子的序列分析96-97

4.

2.2 瞬时表达中Rep启动子的GUS活性97-100

4.

2.3 TbCSA Rep基因表达调控分析100-103

4.3 讨论103-105
附 侵染夜香牛的双生病毒分子鉴定105-114
1 材料和办法105-108

1.1 病毒分离物105

1.2 克隆办法105-106

1.3 病毒基因组序列分析106-108

2 结果与分析108-113

2.1 病毒DNA结构108-110

2.2 病毒伴随卫星分子的结构特点110-113

3 讨论113-114
全文小结114-115
参考文献115-132
附录A 本文所用病毒缩写及中英文对照132-134
附录B 常用培养基及缓冲液配方134-138
作者攻读博士学位期间取得的科研成果138