探讨锦鸡柠条锦鸡儿组织培养系统建立及其肉桂醇脱氢酶基因克隆与生物信息学

论文导读：
摘要：柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom)是广泛分布于内蒙古地区的一种多年生灌木,具有极强的抗逆性,可从抗寒、抗热、抗旱、抗盐碱,是防风固沙的优良树种,家畜的优良饲料,具有很高的经济效益。过去对柠条锦鸡儿的探讨多集中在生理生态方面,而如今其品质改良、分子方面的探讨愈来愈受到人们的重视,使得柠条锦鸡儿的组织培养与遗传转化成为限制进一步探讨使用柠条锦鸡儿的重要因素。木质素是细胞壁中仅次于纤维素的一种重要成分,对植物具有增多机械强度、运输水分及抵御外界不良环境的重要意义,对人类的生产、生活也存在重要的影响。肉桂醇脱氢酶(CAD)在三种木质素合成历程中均起到重要意义,可从催化肉桂醛转化为相应的肉桂醇。由此,对木质素合成基因CAD的探讨非常重要。本探讨从柠条锦鸡儿子叶节为外植体,经过器官再生途径产生再生植株,初步建立了柠条锦鸡儿的组织培养系统,为柠条锦鸡儿遗传转化系统的建立奠定基础。根据已报道植物的木质素合成基因CAD的保守区设计简并引物,并结合RT-PCR及RACE技术,首次克隆到柠条锦鸡儿CAD基因的cDNA全长序列及基因组DNA(gDNA)全长序列,并将cDNA全长序列命名为CkCAD (GenBank登录号为HQ829861),并对其进行生物信息学分析。主要探讨结果如下：1.对柠条锦鸡儿野生种子采取75%乙醇预处理10min,再用10%NaClO处理40min的办法进行表面消毒,其污染率低,且不影响幼苗的生长。2.从柠条锦鸡儿无菌苗子叶、胚轴为外植体诱导愈伤组织,发现在MS+0.5mg/L6-BA+2mg/L2,4-D培养基上可诱导大量的愈伤组织,在增殖培养基MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D中长势良好,但难从分化成芽。3.从柠条锦鸡儿无菌苗子叶节为外植体,通过设计三因素四水平正交试验筛选出最佳芽诱导条件为,在B5培养基上萌发6天的子叶节芽诱导效率最高；优化后丛生芽诱导条件为,6-BA浓度为2.0mg/L时丛生芽长势良好,多数长丛生芽的外植体有2个芽,其次为3-5个芽,少数有8个芽。4.将丛生芽切下进行生根实验,通过进行三因素四水平正交试验筛选得到最佳生根条件为：1/8MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA,最高生根率为66.67%,一个幼苗平均可生出2.91条根。5.生根后的幼苗在水中炼苗后,移栽到蛭石：营养土=1:1的基质中,三周后幼苗的成活率为93.22%。6. CkCAD序列长度为1,287bp,具备长度为1,074bp的完整阅读框,起始子为ATG,终止子为TGA。此外,该序列还有95bp的5′调控区、118bp的3’非编码区和polyA(11)尾巴。预测其编码的蛋白质含357个氨基酸,等电点为5.44,相对分子质量为38.75kD,二级结构主要由α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲组成,并对其结构进行了预测。体系进化分析发现,CkCAD与豆科植物紫花苜蓿CAD2和银合欢CAD的亲缘联系最近。7.柠条锦鸡儿CAD基因的gDNA全长为2,016bp,具有五个外显子和四个内含子。内含子左侧边界均为GT,右侧边界均为AG,符合真核生物内含子的结构特征。8.构建了柠条锦鸡儿CAD基因的过表达载体35S::CAD,并转化野生型拟南芥(Col-0),卡那霉素抗性筛选后已经获得T3代纯合体植株。关键词：柠条锦鸡儿论文丛生芽论文肉桂醇脱氢酶论文生物信息学分析论文
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Abstract5-10
1 引言10-14

1.1 柠条锦鸡儿组织培养系统的建立10-11

1.1 柠条锦鸡儿生物学特性与用途10

1.2 柠条锦鸡儿组织培养及遗传转化探讨近况10-11

1.3 探讨目的及作用11

1.2 柠条锦鸡儿肉桂醇脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析11-14

1.2.1 木质素的生物学功能极为使用11-12

1.2.2 木质素的生物合成途径概述12

1.2.3 CAD的探讨发展12-13

1.2.4 探讨目的与作用13-14

2 材料和办法14-27

2.1 试验材料14

2.2 培养基及激论文导读：分析27-464.1柠条锦鸡儿种子表面消毒办法试验27-284.2柠条锦鸡儿愈伤组织的诱导284.3柠条锦鸡儿丛生芽的诱导28-334.3.1诱导丛生芽最佳条件的正交试验28-314.3.2诱导丛生芽条件的优化31-334.4柠条锦鸡儿生根培养33-364.4.1不同生根激素意义的对比334.4.2最佳生根条件的正交试验33-364.5炼苗、移栽36-374.6柠条锦鸡
素的配制14-16

2.1 培养基的配制14-15

2.2 激素的配制15-16

2.3 试剂、菌种与载体16

2.4 培养条件16

2.5 引物合成与测序16-17

2.5.1 柠条锦鸡儿CAD基因中间片段简并引物的设计16

2.5.2 柠条锦鸡儿CAD基因RACE引物的设计16-17

2.5.3 柠条锦鸡儿CAD基因全长引物的设计17

2.6 试验办法17-27

2.6.1 柠条锦鸡儿种子表面消毒办法试验17-18

2.6.2 柠条锦鸡儿愈伤组织的诱导18

2.6.3 柠条锦鸡儿丛生芽的诱导18-19

2.6.4 柠条锦鸡儿生根培养19-20

2.6.5 炼苗、移栽20

2.6.6 柠条锦鸡儿木质素基因CAD的克隆20-24

2.6.7 生物信息学分析24

2.6.8 柠条锦鸡儿CAD基因过表达转基因纯合体拟南芥的获得24-27

3 数据统计办法27
4 结果与分析27-46

4.1 柠条锦鸡儿种子表面消毒办法试验27-28

4.2 柠条锦鸡儿愈伤组织的诱导28

4.3 柠条锦鸡儿丛生芽的诱导28-33

4.

3.1 诱导丛生芽最佳条件的正交试验28-31

4.

3.2 诱导丛生芽条件的优化31-33

4.4 柠条锦鸡儿生根培养33-36

4.1 不同生根激素意义的对比33

4.2 最佳生根条件的正交试验33-36

4.5 炼苗、移栽36-37

4.6 柠条锦鸡儿CAD基因的克隆与生物信息学分析37-39

4.6.1 CAD中间片段的获得37

4.6.2 CAD基因cDNA 3’RACE扩增3’末端序列37

4.6.3 CAD基因cDNA 5’RACE扩增5’末端序列 #2837

4.6.4 CAD基因cDNA全长的获得37-38

4.6.5 CAD基因gDNA全长的获得38-39

4.7 生物信息学分析39-44

4.7.1 柠条锦鸡儿CAD基因ORF分析39-40

4.7.2 CAD基因cDNA全长与gDNA全长的对比40-41

4.7.3 柠条锦鸡儿CAD基因氨基酸序列分析41-42

4.7.4 柠条锦鸡儿CAD基因体系进化树分析42-44

4.8 柠条锦鸡儿CAD基因过表达转基因纯合体拟南芥的获得44-46

4.8.1 柠条锦鸡儿CAD基因过表达载体的构建44-45

4.8.2 表达载体的农杆菌转化45

4.8.3 转基因植株的筛选45-46

5 结论与讨论46-50

5.1 结论46

5.2 讨论46-50

5.

2.1 柠条锦鸡儿种子的表面消毒46-47

5.

2.2 柠条锦鸡儿愈伤组织的诱导47

5.

2.3 柠条锦鸡儿丛生芽的诱导47

5.

2.4 柠条锦鸡儿生根培养47-48

5.

2.5 柠条锦鸡儿炼苗、移栽48

5.

2.6 柠条锦鸡儿组织培养系统优化48

5.

2.7 柠条锦鸡儿肉桂醇脱氢酶基因的克隆48-50

致谢50-51
参考文献51-56
作者介绍56