对于基因治疗CRAd.pEgrl-TRAIL-Smac联合放射对MDA-MB-231细胞杀伤效应

论文导读：
摘要：恶性肿瘤作为一种全身性疾病，其产生是由多基因、多途径及多因素参与逐步进展的复杂历程，单一疗法往往难从取得满意疗效，由此，合理地选择综合治疗的方式为有效地杀伤肿瘤细胞，彻底治愈癌症带来了希望。肿瘤基因-放射治疗的提出弥补了放射治疗与基因治疗各自的弊端，将二者有机地结合起来，发挥协同抗肿瘤意义，既增强了肿瘤组织对放射治疗的敏感性、提升外源基因靶向转移和杀伤肿瘤细胞的效率，同时也可从降低照射剂量，缓解射线对肿瘤周围正常组织的损伤。本探讨使用对肿瘤细胞具有靶向性的溶瘤腺病毒作为载体，使用Egr-1启动子可在辐射诱导下增强其下游目的基因表达的特性，从及TRAIL和Smac基因的协同促肿瘤细胞凋亡的意义，构建了携带TRAIL和Smac双基因的具有双重靶向的pAd.Egr1-TRAIL-Smac-hTERT-E1A-E1B-E1B55K的溶瘤腺病毒质粒，并在HEK293细胞中成功地将其包装成携带Egr-1启动子、TRAIL和Smac双基因的双重靶向溶瘤腺病毒CRAd.pEgr1-TRAIL-Smac，研究在其联合X射线照射对MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响，从及MDA-MB-231细胞凋亡途径中相关基因的mRNA和蛋白表达规律。实验结果表明，CRAd.pEgr1-TRAIL-Smac联合X射线照射对MDA-MB-231细胞具有显著的增殖抑制极为促凋亡意义，可使细胞中TRAIL、DR5、Smac、Cytc、caspase-8、-9和-3mRNA及蛋白表达增高。结果提示，CRAd.pEgr1-TRAIL-Smac联合放疗抑制MDA-MB-231细胞增殖和推动其凋亡的机制，涉及细胞S期和G2期阻滞及死亡受体途径与线粒体途径中TRAIL、DR5、Smac、Cytc、caspase-8、-9和-3等基因的相互意义。本探讨结果为临床治疗肿瘤提供了重要的论述依据及实验基础。关键词：X射线论文TRAIL论文Smac论文条件复制型腺病毒论文基因治疗论文放射治疗论文
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中文摘要6-12
Abstract12-21
第1章 绪论21-47

1.1 肿瘤的基因治疗21-28

1.1 基因治疗的进展及近况21-22

1.2 肿瘤基因治疗22-28

1.2 肿瘤放射治疗28

1.3 肿瘤的基因放射治疗28-34

1.3.1 肿瘤基因-放射治疗的种类29-31

1.3.2 由Egr-1启动子介导的肿瘤基因-放射治疗31-34

1.4 溶瘤病毒与肿瘤治疗34-40

1.4.1 腺病毒的基本生物学特点35-36

1.4.2 腺病毒载体进展历程36-37

1.4.3 条件复制型腺病毒载体37-39

1.4.4 条件复制型腺病毒与肿瘤的治疗39-40

1.5 TRAIL基因与肿瘤治疗40-43

1.5.1 TRAIL基因的分子结构与生物学特性40-41

1.5.2 TRAIL基因与细胞凋亡41-42

1.5.3 TRAIL基因与肿瘤治疗42-43

1.6 AC基因与肿瘤治疗43-46

1.6.1 Smac基因的分子结构及及生物学特性43-44

1.6.2 Smac与细胞凋亡44

1.6.3 Smac与肿瘤治疗44-46

1.7 立题依据46-47

第2章 材料与办法47-69

2.1 主要试剂及实验器材47-50

2.

1.1 试剂47-49

2.

1.2 实验器材49-50

2.2 主要实验仪器50-51

2.3 细胞株51

2.4 质粒与菌株51

2.5 照射条件51-52

2.6 细胞生物学实验办法52-54

2.6.1 培养液配制52

2.6.2 胎牛血清的制备52

2.6.3 平衡盐溶液的配制52-53

2.6.4 0.25%胰酶溶液的配制53

2.6.5 细胞培养53

2.6.6 细胞冻存53

2.6.7 细胞复苏53-54

2.6.8 CCK-8试剂盒检测细胞增殖54

2.6.9 检测细胞凋亡54

2.6.10 FCM法检测细胞周期54

2.7 分子生物学实验办法54-68

2.7.1 细菌培养技术54-57

2.7.2 重组穿梭载体的构建57-59

2.7.3 重组腺病毒的包装与鉴定59-63

2.7.4 目的基论文导读：Smac、DR5、Cytc、caspase-8、-9和-3基因mRNA的表达变化89-1003.4.22.0GyX射线照射后重组腺病毒感染的MDA-MB-231细胞中TRAIL、ac、Cytc、DR5、caspase-9、-8和-3基因蛋白表达的变化100-107第4章讨论107-1154.1条件复制型腺病毒载体构建及病毒包装109-1104.2重组腺病毒联合2.0GYX射线照射对乳腺癌MDA-MB-231细胞的
因蛋白表达水平的检测63-68

2.8 统计学办法68-69

第3章 实验结果69-107

3.1 重组质粒的构建及鉴定69-73

3.

1.1 目的基因的获得69-71

3.1.2 重组质粒pShuttle-Egr1-TRAIL-Smac-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定71-73

3.2 重组腺病毒的包装及鉴定73-78

3.

2.1 重组腺病毒质粒构建73-75

3.

2.2 重组腺病毒的包装75

3.

2.3 重组腺病毒的扩增75-76

3.

2.4 重组腺病毒滴度的测定76-77

3.

2.5 重组腺病毒的鉴定77-78

3.3 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB-231细胞的杀伤意义78-89

3.1 重组腺病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响78-80

3.2 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB- 231细胞增殖的影响80-83

3.3.3 重组腺病毒联合

2.0GyX射线照射对MDA-MB- 231细胞凋亡的影响83-85

3.3.4 重组腺病毒联合

2.0GyX射线照射对MDA-MB- 231细胞周期进程的影响85-89

3.4 重组腺病毒在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的辐射诱导表达规律89-107
3.4.1 2.0GyX射线照射后重组腺病毒感染的MDA- MB- 231细胞中TRAIL、Sm ac、DR5 、Cytc 、caspase-8、-9和- 3基因mRNA的表达变化89-100
3.4.2 2.0GyX射线照射后重组腺病毒感染的MDA-MB-231细胞中TRAIL、ac、Cytc、DR

5、caspase-9、-8和-3基因蛋白表达的变化100-107

第4章 讨论107-115

4.1 条件复制型腺病毒载体构建及病毒包装109-110

4.2 重组腺病毒联合

2.0GYX射线照射对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤意义110-115

4.2.1 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB-231细胞的生长抑制意义110-111
4.2.2 重组腺病毒联合X射线照射对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡极为周期进程的影响111-112
4.2.3 重组腺病毒联合X射线照射对MDA-MB-231细胞中凋亡相关基因的表达影响112-115
结论115-117
参考文献117-129
攻读学位期间发表的学术论文极为他成果129-131
致谢131