阐释海绵状少突胶质细胞凋亡与海绵状白质脑病发病机制结论

论文导读：5例对照脑标本，年龄54-80岁。取材额叶，小脑和胼胝体，分别进行H．E，K．B染色。GFAP，MBP，COX-2，CNPase，Caspase-3免疫组化染色；免疫荧光染色；TUNEL细胞凋亡检测和髓鞘电镜检查。结合显微图像分析仪进行定量分析。将2000年3月至2006年10月在南方医院住院的39例HSLE患者进行临床分析，找出其中出现意识障碍的患者，分为意识障碍组与非
摘要：【背景与目的】海绵状白质脑病(Heroin Spongiform Leucoencephalopathy，HSLE)是一种与烫吸有关的脑白质病。该病在世界上首先由Wolters E等于1982年在荷兰阿姆斯特丹报道47例，其特点为：1)经鼻烫吸后发病；2)临床上从小脑受损为突出体现3)影像体现大脑、小脑白质的广泛对称性转变4)病理转变从脑白质海绵状空泡变性为其特点。此后，德国、美国、比利时、意大利、瑞士、挪威、西班牙从及台湾地区等地也相继报道多起个案。2000年广东地区出现了经鼻吸食之后出现的从小脑、锥体束受损为主要临床体现的病例，并由陆兵勋等最先报道了28例确诊为HSLE的患者，此为中国大陆首次出现并成批爆发，因其临床体现、影像学转变和病理转变均与荷兰学者报道相似，陆兵勋等认为是该病在世界范围内的第二次爆发流行。因其发病与烫吸有关，脑白质病理呈海绵状转变，因而诊断为海绵状白质脑病。HSLE不同于已知的各种相关性脑病，也不同于其他代谢性脑海绵状转变的疾病。HSLE具体的病因从及发病机制目前不明，相关的病理探讨资料非常有限并且各家报道的结果并非完全一致。为此，本探讨试图在我们既往探讨本病的病理基础上进行更深一步的探讨，并结合动物实验和临床来揭示HSLE的发病机制。为了了解HSLE的发病机制，本论文分别进行了杂质提取物和的SD大鼠熏蒸实验，用双环己酮草酰二腙诱导出海绵状白质空泡变性的SD大鼠实验模型，发现细胞凋亡这一新的探讨线索。在此基础之上，通过对HSLE少突胶质细胞凋亡的探讨和凋亡机制的研究，分析HSLE意识障碍及与急性中毒性脑病的临床探讨，综合说明HSLE的发病机制。【材料与办法】所有60只SD大鼠均由南方医科大学动物中心提供。一组：30只SD大鼠，体重200—220克，雌雄各半，随机分为三组，分别采取以样品中检测出的杂质异烟肼、安定、和滑石粉作为实验组，市售作为组，每日熏蒸1次，每次20分钟，共两周。取鼠脑，进行H．E染色，观察脑白质有无异常转变。二组30只4—6周180—200克SD大鼠，雌雄各半，随机分为实验4周和6周二组，予2％双环己酮草酰二腙混悬液，10mg／100克体重／24小时，经口腔食管灌胃，1次／日。对照组予等剂量生理盐水灌胃，共6周。鼠脑标本分别进行H．E染色，hoechst33258细胞凋亡染色，caspase-3 RT-PCR和髓鞘电镜观察。收集2000年3月至2004年4月南方医院剖检的HSLE脑标本4例，年龄26—38岁，对照2例，年龄54和66岁，通过免疫组化法进行Taul，Tau3和MAP2微管蛋白的探讨。对2000年3月至2004年4月南方医院剖检的HSLE脑标本4例，年龄26—38岁，和5例对照脑标本，年龄54-80岁。取材额叶，小脑和胼胝体，分别进行H．E，K．B染色。GFAP，MBP，COX-2，CNPase，Caspase-3免疫组化染色；免疫荧光染色；TUNEL细胞凋亡检测和髓鞘电镜检查。结合显微图像分析仪进行定量分析。将2000年3月至2006年10月在南方医院住院的39例HSLE患者进行临床分析，找出其中出现意识障碍的患者，分为意识障碍组与非意识障碍组进行对比，并将意识障碍组与同期6例急性中毒性脑病进行临床比较分析。【结果】杂质提取物实验及市售大鼠熏蒸实验，脑组织大体病理未见显著异常，切开见脑皮质结构完整，灰白质界线分明，H．E染色未见白质有空泡样转变形成。双环己酮草酰二腙灌注法实验性SD大鼠脑白质空泡样转变结果：部分脑膜与颅骨之间有轻度粘连，脑表面颜色灰白，切面灰白质分界清楚，小脑半球灰白质结构清晰，脑白质区无扩大。电镜：髓鞘板层内有空泡形成，多部位髓鞘被涡轮状空泡所裂解。H．E染色：6周组中10例大鼠中有7例在脑干出现空泡样转变，大脑白质深层有4例出现白质空泡样变；4周组均未见异常。小脑白质均未见空泡样转变。hoechst33258细胞凋亡染色：在实验组4周有7例脑干和5例大脑深层白质6周有7例脑干和6例大脑深层白质见有细胞核荧光着色的阳性凋亡细胞。对照细胞核未见DNA阳性转变。Caspase-3RT—PCR显示四周时见部分表达，而到第六周显示表达显著。免疫组化微管相关蛋白：论文导读：8±5.28，与对照1.42±1.16，0.83±0.94，0.58±0.67相比显著增高，并有明显性差别(t值分别为11.74，9.45和7.85，P=0.000)。CNPase免疫组化染色：胞浆呈黄棕色或褐色。对照组小脑、额叶、胼胝体白质CNPase阳性细胞数均数加减标准差分别为：16.75±5.88：17.42±4.08：17.67±

3.77。HSLE的小脑、额叶、胼胝体白质CNPase阳性细胞数分别为：12.50

Taul，Tau3和MAP2微管蛋白在HSLE未见显著的阳性表达。4例HSLE脑标本检查H．E染色：HSLE小脑白质结构呈显著大小不等的空泡样转变，与对照相比可见各层结构已有所破坏，由浅层白质向深层白质过渡空泡样转变越加显著。对照额叶灰白质交界处染色，显示灰白结构分明，而HSLE额叶灰白交界处染色，可见白质显著空泡形成，结构散乱，但U型纤维相对完整。MBP免疫组化：免疫组化MBP染色HSLE与对照深层白质MBP灰度值对比(t=3.93，P=0.011)，具有明显性差别。HSLE深层白质与浅层白质和灰质的灰度值对比(t=4.587，P=0.006：t=5.412，P=0.003)，均具有明显性差别。GFAP免疫组化：GFAP免疫组化染色可见星形胶质细胞在HSLE病灶区的两个明显性特点转变：1，在病灶边缘地带可见星形胶质细胞成簇积聚，与对照星形胶质细胞均匀分布形成显著差别。2，在病灶中心区域，星形胶质细胞较对照相对少，但可见星形胶质细胞在细胞胞体上显著增大，细胞周围有显著的浓染颗粒。HSLE组白质深层与白质浅层相比有明显性差别(t=23.43，P=0.000)；对照组白质深层与HSLE组白质深层相比有明显性差别(t=22.88，P=0.000)；对照组白质浅层与HSLE组白质浅层相比有明显性差别(t=10.16，P=0.000)。显示HSLE病灶区星形胶质细胞有肥大无增生的转变特点。免疫组化caspase-3染色：免疫组化染色可见HSLE病灶区胞浆黄褐色的Caspase-3蛋白阳性的少突胶质细胞，与对照对比两者具有明显性差别(t=10.38，P=0.000)。Caspase-3蛋白阳性分布从浅层白质髓鞘轻度转变处为最显著，深层白质有少量Caspase-3蛋白阳性的少突胶质细胞出现。TUNEL凋亡细胞检测：HSLE白质可见少突胶质细胞凋亡，深层白质可见凋亡小体，体现为细胞核着色，部分核浓缩，小脑、胼胝体、额叶白质均有少突胶质细胞凋亡表达，(细胞数均数加减标准差分别为8.08±4.42；12.83±5.20；12.92±4.80)显著高于对照组(P=0.000)。免疫荧光双标染色：COX-2+Caspase从及CNPase+Caspase，均可见双重染色阳性标记。表明凋亡从及COX-2的转变是发生在少突胶质细胞。COX-2免疫组化染色：胞浆呈黄棕色或红褐色的COX-2阳性表达，HSLE的小脑、额叶、胼胝体白质COX-2阳性细胞数均数加减标准差分别为12.83±3.81，15.33±4.81，和13.08±5.28，与对照1.42±1.16，0.83±0.94，0.58±0.67相比显著增高，并有明显性差别(t值分别为11.74，9.45和7.85，P=0.000)。CNPase免疫组化染色：胞浆呈黄棕色或褐色。对照组小脑、额叶、胼胝体白质CNPase阳性细胞数均数加减标准差分别为：16.75±5.88：17.42±4.08：17.67±3.77。HSLE的小脑、额叶、胼胝体白质CNPase阳性细胞数分别为：12.50±5.39：13.08±4.14：12.75±4.03，阳性表达较对照减少(t=2.219，P=0.048；t=2.229，P=0.048和t=3.335，P=0.007)。COX-2／CNPase表达分析：CNPase与COX-2体现相反，在病灶区的表达显著下调，使得HSLE体现出明显的COX-2表达上调和CNPase表达下调转变特点。HSLE意识障碍与非意识障碍临床分析：常规检查，意识障碍组除血浆蛋白较非意识障碍组减低外，脑脊液检查无显著区别。意识障碍组所有患者均体现出中度—重度脑电图的异常，尤为显著的是3例入院时意识清楚但逐渐发展致浅昏迷的患者，显示出高度异常的脑电图体现，非意识障碍组仅10％有轻度异常，两组间差异明显。影像转变：非意识障碍组患者病灶受累的范围显著小于意识障碍组。通过表格计算得出：意识障碍组(?)±s=70.09±39.65；非意识障碍组(?)±s=41.79±11.40。两组相对比t=3.427，P=0.005，显示两组之间有统计学差别。SPECT脑灌注显像体现为白质为主的放射性稀疏。非意识障碍组主要体现为大脑后纵裂枕叶低灌注显像，呈对称性；而意识障碍组体现为大，小脑白质区均扩大，呈放射状稀疏或缺损，脑论文导读：137致谢137-139上一页123
灰质区见多发低血供灶。HSLE意识障碍与急性中毒性脑病：急性中毒性脑病有很高的并发感染的概率，但两组生化检查相差不大。在血气分析检查上，急性中毒性脑病较HSLE有更多的异常体现。脑电图检查；两组均从弥漫性慢波活动为主，呈中—重度异常转变。MRI检查：HSLE体现为双侧大脑半球，小脑，胼胝体，脑干，内囊后肢，半卵圆中心，放射冠白质的广泛，对称性的长T1，长T2转变。急性中毒性脑病的影像转变则体现为弥漫性脑肿胀或灰质神经核团受累征象，并合并有局灶性同时累计灰白质的转变。转归：HSLE意识障碍组9例患者死亡6例，急性中毒性脑病6例患者无死亡病例。【结论】1、S-D大鼠用灌注法给与双环己酮草酰二腙，可从诱导出脑白质空泡样转变动物模型，该白质空泡样转变与白质内细胞凋亡有密切关系。以杂质中分离出的异烟肼、安定、和滑石粉给与SD大鼠两周的熏蒸实验不能诱导出白质空泡样转变的动物模型。2、HSLE不是神经体系变性疾病。3、HSLE海绵状白质广泛变性，病灶区发现大量少突胶质细胞凋亡，尤从病灶边缘部位显著。CNPase下调／COX-2上调导致少突胶质细胞凋亡。COX-2抑制剂消炎痛可从用于HSLE患者的治疗。4、脑电图异常是海绵状白质脑病患者发生意识障碍转变的重要异常体现；海绵状白质脑病患者病灶范围的大小与能否出现意识障碍密切相关；脑局灶性的低灌流，尤其是在灰质的低灌流可能是引起抽搐，进而导致意识障碍的理由之一。HSLE意识障碍者体现为双侧大脑半球，小脑，胼胝体，内囊后肢，半卵圆中心，放射冠白质的广泛，对称性的长T1，长T2转变。急性中毒性脑病的影像转变则体现为弥漫性脑肿胀或灰质神经核团受累征象，并合并有局灶性同时累计灰白质的转变，HSLE发生意识障碍较急性中毒性脑病有更高的病死率。关键词：海绵状白质脑病论文病理染色论文免疫组化论文少突胶质细胞论文凋亡论文意识障碍论文
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ABSTRACT9-19
前言19-24
第一章 海绵状白质转变大鼠模型的建立和鼠脑白质海绵状转变机制研究24-52
材料与办法26-35
结果35-41
讨论41-47
结论47-52
第二章 微管相关蛋白转变与海绵状白质脑病发现机制探讨52-68
材料与办法54-59
结果59-62
讨论62-64
结论64-65
参考文献65-68
第三章 少突胶质细胞凋亡引起海绵状白质脑病68-97
材料与办法69-79
结果79-88
讨论88-93
结论93-94
参考文献94-97
第四章 海绵状白质脑病意识障碍的临床分析97-125
前言97
第一节 海绵状白质脑病患者意识障碍与非意识障碍的临床分析97-105
材料与办法97-103
结果103-105
结论105
第二节 海绵状白质脑病意识障碍与急性中毒性脑病意识障碍的临床分析105-125
材料与办法105-111

2.1 材料105-106

2.2 办法106-110

2.3 结果110-111

讨论111-112
综合讨论112-122
参考文献122-125
综述125-135
附录 (缩略词表)135-136
在读博士期间撰写和发表的论文136-137
致谢137-139