试议土贝母土贝母苷甲诱导人肝癌HepG2细胞凋亡机制

论文导读：胞系Eca-109、人宫颈癌细胞系Hela,人肝癌细胞系HepG2、人前列腺癌细胞系PC-3、人胃癌细胞系SGC-7901)的细胞毒性。实验结果表明,土贝母苷甲能有效的地抑制这7种肿瘤细胞的生长,具有良好的抗肿瘤意义。其中人肝癌细胞系HepG2对土贝母苷甲的意义最为敏感,于是后续的实验选用HepG2细胞作为探讨对象。针对凋亡发生的特点性质,采取
摘要：土贝母苷甲是以传统中药土贝母中分离纯化得到的一种三萜皂苷化合物。药用土贝母为葫芦科土贝母属植物土贝母[Bolbostemma paniculatum (Maxim.) Franquet]的块茎。土贝母原载于清代赵氏编纂的《本草纲目拾遗》,在《中药大辞典》和《中华人民共和国药典》中都有土贝母的相关记载。其性味苦、微寒,归肺、脾经,有清热解毒、消肿散结等功效。土贝母中含有皂苷类、甾醇极为苷类和酯类、生物碱类等多种化学成分。其中皂苷类含量较大,为土贝母的主要活性成分。土贝母苷甲是以土贝母中分离纯化,且得率最高的抗癌活性成分。近年来,有关土贝母苷甲的探讨表明,土贝母苷甲具有抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的意义。本课题采取生物化学和分子生物学等技术办法,探讨了土贝母苷甲诱导细胞发生凋亡的分子途径和细胞生物学机制,探讨了土贝母苷甲与微管蛋白的相互意义,从期进一步阐明土贝母苷甲抗肿瘤意义的分子机理,并试图探讨土贝母苷甲在细胞内的意义靶点,为将其开发成新的抗癌药物奠定基础。1.土贝母苷甲抗肿瘤意义的凋亡机制探讨采取MTT法测定了土贝母苷甲对7种不同来源的癌细胞(人肺癌细胞系A-549、人肝癌细胞系Bel-7402、人食道癌细胞系Eca-109、人宫颈癌细胞系Hela,人肝癌细胞系HepG2、人前列腺癌细胞系PC-3、人胃癌细胞系SGC-7901)的细胞毒性。实验结果表明,土贝母苷甲能有效的地抑制这7种肿瘤细胞的生长,具有良好的抗肿瘤意义。其中人肝癌细胞系HepG2对土贝母苷甲的意义最为敏感,于是后续的实验选用HepG2细胞作为探讨对象。针对凋亡发生的特点性质,采取了如下的检测手段,测定了土贝母苷甲对HepG2细胞的凋亡意义。通过荧光染色法观察了土贝母苷甲对HepG2细胞核形态的影响。数据分析表明,土贝母苷甲的意义能使HepG2细胞的细胞核皱缩、聚集,并破碎成凋亡小体。采取琼脂糖凝胶电泳分析了经土贝母苷甲处理后的HepG2细胞的DNA,结果发现,土贝母苷甲能促使HepG2细胞的DNA呈凋亡特点性的片段。这些形态学的变化,可从初步断定土贝母苷甲对HepG2细胞的凋亡意义。为了进一步确定土贝母苷甲能引起HepG2细胞发生凋亡,接下来利用免疫印迹实验测定了土贝母苷甲对HepG2细胞内凋亡执行分子caspases表达的影响。Caspases家族蛋白是凋亡发生的执行蛋白,在体内处于酶原形论文导读：/M周期阻滞和活性氧水平增高,以而引起凋亡历程的发生,在这个历程当中NF-κB和JNK的信号通路起到了重要意义,而且p53也参与了该历程的调控。2.土贝母苷甲与微管蛋白的相互意义为了寻找土贝母苷甲在体内的意义靶点,证实土贝母苷甲与微管蛋白的相互意义,首先探讨了土贝母苷甲对HepG2细胞中微管蛋白表达的影响。结果发现,土贝母苷
式。当凋亡发生的时候,caspases家族的蛋白被水解成活化形式,以而产生执行凋亡的意义。凋亡的分子途径分为两种,一种是外源途径,一种是内源途径。不同的caspases蛋白在不同的途径中起到不同的意义。实验中检测的是caspase-8,-9,-3三种蛋白。其中caspase-8通过外源途径的上游分子激活,caspase-9通过内源途径的上游分子激活,它们的活化最终导致caspase-3的激活。实验结果证明,经过土贝母苷甲的意义后的HepG2细胞内的caspase-8,-9,-3均发生了酶原形式到活化形式的改变。这样,可从基本确定土贝母苷甲对HepG2细胞的凋亡意义。同时,对外源途径和内源途径上游分子也同样进行了免疫印迹实验。调控外源途径的Fas蛋白极为配体FasL(Fas Ligand)在土贝母苷甲的意义下,随着时间和浓度的增多,在细胞内的表达量也显著增多。这说明了,凋亡历程中外源途径被激活。调控内源途径的Bcl-2家族的蛋白也在土贝母苷甲的意义下,表达量发生了转变。其中抗凋亡的Bcl-2蛋白显著降低,而促凋亡的Bak蛋白显著升高。这说明了,凋亡历程中内源途径也同样参与了意义。这些实验结果表明,土贝母苷甲能诱导HepG2细胞产生凋亡,并且该历程由外源途径和内源途径的共同参与调控完成的。采取流式细胞术检测了土贝母苷甲对HepG2活性氧水平的调控和细胞周期的影响。结果显示,土贝母苷甲的意义能促使HepG2细胞内活性氧水平的显著增高。在低浓度和短时间意义下,土贝母苷甲能显著促使HepG2细胞周期阻滞在G2/M期。随着意义浓度和时间的延长,细胞的亚二倍体峰显著增高。在细胞凋亡发生之前,土贝母苷甲能引起HepG2细胞的G2/M期周期阻滞。通过免疫印迹法检测了该历程的几个调控因子。土贝母苷甲能抑制TNF-a和NF-κB在HepG2细胞中的表达,能推动JNK分子的磷酸化,而p53蛋白的表达也在该历程中受到影响。说明土贝母苷甲引起细胞G2/M周期阻滞和活性氧水平增高,以而引起凋亡历程的发生,在这个历程当中NF-κB和JNK的信号通路起到了重要意义,而且p53也参与了该历程的调控。2.土贝母苷甲与微管蛋白的相互意义为了寻找土贝母苷甲在体内的意义靶点,证实土贝母苷甲与微管蛋白的相互意义,首先探讨了土贝母苷甲对HepG2细胞中微管蛋白表达的影响。结果发现,土贝母苷甲处理后的细胞内,微管蛋论文导读：背景15-181.2土贝母苷甲的探讨背景18-222细胞凋亡22-372.1凋亡的分子信号通路23-242.2凋亡相关的调控蛋白24-302.3导致细胞凋亡的因素30-373微管蛋白37-463.1微管及微管蛋白的结构与功能37-393.2意义微管的抗肿瘤药物探讨近况39-464本课题的探讨内容及作用46-49第二章土贝母苷甲诱导HepG2肝癌细胞凋亡的分子信号通
白的表达量增高。之后以猪脑中采取二次聚合-解聚的分离纯化办法得到了纯度高、含量大的微管蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳办法检测提取得到的蛋白纯度高于95%,利用BCA蛋白定量试剂盒检测其浓度是6359.12ug/ml。通过免疫印迹法,用微管蛋白抗体检测得到的结果呈阳性,确定提取得到的蛋白就是微管蛋白。采取荧光光谱法和分子模拟技术,对土贝母苷甲和微管蛋白的相互意义进行了探讨。荧光光谱分析结果表明,土贝母苷甲能引起微管蛋白内源荧光的淬灭,说明了土贝母苷甲在体外与微管蛋白能发生相互意义。分子模拟结果表明,土贝母苷甲结合在微管蛋白两个亚基之间,其结合位点不同于秋水仙碱与微管蛋白的结合位点,也不同于紫杉醇与微管蛋白的结合位点。土贝母苷甲与微管蛋白的结合能形成两个氢键。关键词：土贝母苷甲论文HepG2细胞论文凋亡论文微管蛋白论文相互意义论文
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摘要6-9
ABSTRACT9-12
主要缩写说明12-13
目录13-15
第一章 绪论15-49
1 土贝母苷甲15-22

1.1 土贝母的探讨背景15-18

1.2 土贝母苷甲的探讨背景18-22

2 细胞凋亡22-37

2.1 凋亡的分子信号通路23-24

2.2 凋亡相关的调控蛋白24-30

2.3 导致细胞凋亡的因素30-37

3 微管蛋白37-46

3.1 微管及微管蛋白的结构与功能37-39

3.2 意义微管的抗肿瘤药物探讨近况39-46

4 本课题的探讨内容及作用46-49
第二章 土贝母苷甲诱导HepG2肝癌细胞凋亡的分子信号通路探讨49-75
引言49
1 实验材料与办法49-56

1.1 材料、试剂与仪器49-50

1.2 试剂的配制50-52

1.3 实验办法52-56

2 实验结果与分析56-71

2.1 土贝母苷甲对细胞活力的抑制结果56-57

2.2 土贝母苷甲对细胞形态的影响57-59

2.3 土贝母苷甲对细胞核的荧光染色观察59-60

2.4 土贝母苷甲对细胞DNA的片段化60-61

2.5 土贝母苷甲对caspase-3,-8,-9的激活61-63

2.6 土贝母苷甲对Fas、FasL及Bcl-2家族蛋白成员的表达影响63-65

2.7论文导读：

土贝母苷甲对细胞活性氧水平的影响65-67

2.8 土贝母苷甲对细胞周期的影响67-69

2.9 土贝母苷甲对几个相关信号分子的调控69-71

3 讨论与小结71-75
第三章 土贝母苷甲与微管蛋白的相互意义的探讨75-91
引言75
1 实验材料与办法75-81

1.1 材料、试剂与仪器75-76

1.2 试剂的配制76-78

1.3 实验办法78-81

2 实验结果与分析81-88

2.1 土贝母苷甲对HepG2细胞内微管蛋白表达的影响81-82

2.2 微管蛋白提取纯化的鉴定82-84

2.3 微管蛋白浓度测定84-85

2.4 土贝母苷甲对微管蛋白荧光的淬灭85-86

2.5 土贝母苷甲和微管蛋白分子相互意义的计算机模拟86-88

3 讨论与小结88-91
参考文献91-103
攻读博士期间已发表和待发表的论文103-105
致谢105