研究扩增基于滚环扩增目视法核酸检测技术大专

论文导读：的核酸检测产品。本论文中,我们建立了基于滚环扩增(RCA)和磁珠聚集显色的目视法核酸检测策略(RCA-MPA)。首先设计了具有高度靶向特异性的锁式探针,通过对基因组DNA进行酶切处理得到单链靶向分子,然后进行靶向识别和探针连接,最后进行RCA反应和磁珠聚集显色。磁珠与长链DNA之间通过物理性吸附作用相互缠绕,被磁铁聚集成不易分
摘要：核酸诊断在疾病诊断和治疗中具有重要作用,现有的分子生物学检测技术通常需要精密仪器和专业人员操作,但是在一些边远地区或贫困地区,往往缺乏资金和设备,由此亟待开发出低廉简便的核酸检测产品。本论文中,我们建立了基于滚环扩增(RCA)和磁珠聚集显色的目视法核酸检测策略(RCA-MPA)。首先设计了具有高度靶向特异性的锁式探针,通过对基因组DNA进行酶切处理得到单链靶向分子,然后进行靶向识别和探针连接,最后进行RCA反应和磁珠聚集显色。磁珠与长链DNA之间通过物理性吸附作用相互缠绕,被磁铁聚集成不易分散的团聚物,短链DNA (1kb)则无此功能,由此基于此原理可以对溶液中的扩增产物实现肉眼检测。本论文以人瘤病毒-18(HPV-18) E7基因上的一段序列,作为模型样品,进行RCA-MPA的可行性实验。成功实现靶向特异性测定,检测限为0.62amol (124fM)。此外,还在HeLa细胞内以及添加了靶向分子的血液样品中测到了HPV-18E7基因,初步证明该策略可以用于实际样品浅析。RCA-MPA法具有高特异性、高灵敏度和低成本等特点,有望用于现场诊断。第一章绪论部分介绍了以聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)和RCA为代表的核酸扩增技术的原理、策略和运用,并重点综述了RCA技术的进展、种类、特点以及检测策略和运用。最后介绍了几种适用于现场检测的技术,如芯片实验室、试纸条生物传感器和基于纳米粒子的比色法核酸检测技术等。第二章是L-RCA核酸检测策略的构建。建立了一套以DNA为靶向分子的均相基于连接滚环扩增(L-RCA)扩增系统,通过凝胶电泳考察连接反应和RCA反应的效果,利用外切酶酶切处理的策略,验证连接产物中是否有着环状DNA分子,并且改善连接条件,提升了padlock成环的概率。此外,比较了单引物RCA和双引物RCA的扩增效率和背景干扰程度。最终证实单引物RCA具有更强的区分信号和背景的能力,在现场检测方面拥有巨大的潜能。第三章为HPV-18基因检测。在本工作中,建立了一套基于L-RCA反应和磁珠聚集显色的目视法核酸检测系统。连接反应中以Taq DNA连接酶替代T4DNA连接酶,减少非特异性连接产生的背景信号,提升检测特异性。以磁珠聚集显色策略替代常规的荧光标记策略,实现目视法检测HPV-18病毒E7基因,最低检测限为0.62amol,与常规的肉眼检测策略相比,灵敏度提升了1000倍。该策略被成功用于体外培养的细胞系(HeLa和Huh-7)和添加了靶向分子的血液样品中HPV-18基因的检测,证明具有检测实际样品的能力。综上所述,通过本论文的探讨工作,我们提出了一种基于滚环扩增和磁珠聚集显色的核酸检测技术。不同于以往基于微型化系统的芯片技术,RCA-MPA策略通过等温扩增和聚集显色来实现核酸检测,不需要传统的循环控温系统和荧光检测设备,以策略学方面简化了系统。整个检测历程只需要移液器、恒温设备(水浴锅)和相机(手机)即可完成。不仅大大降低了检测成本,而且使得该技术不受环境和基础设施的限制,可以用于边远地区以及经济不发达地区的基层医疗卫生防疫部门,作为病原体检测和基因相关疾病筛选的工具,具有广阔的进展空间和运用前景。关键词：核酸检测论文滚环扩增论文磁珠论文目视法论文HPV-18论文
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摘要7-9
Abstract9-11
目录11-13
第一章 绪论13-51

1.1 常见核酸检测技术13-19

1.1 PCR13-15

1.2 核酸等温扩增技术15-19

1.2 RCA策略概述19-34

1.2.1 进展历史和原理19-21

1.2.2 RCA反应类型与特点21-25

1.2.3 RCP检测策略25-30

1.2.4 运用30-34

1.3 现场诊断技术34-38

1.3.1 芯片实验室35-36

1.3.2 试纸条生物传感器36-37

1.3.3 基于纳米粒子的比色法37-38

1.4 本论文的探讨背景及作用38-39

1.5 参考文献39-51

第二章 L-RCA核酸检测策略的构建51-58
2.1 引言51-52论文导读：.2.2实验步骤53-542.3结果与讨论54-572.3.1T4DNA连接酶连接产物浅析54-552.3.2电泳条件优化55-562.3.3RCP凝胶电泳分离562.3.4双引物RCA产物凝胶电泳分离56-572.4小结57-58第三章HPV-18基因检测58-803.1引言58-593.2实验部分59-633.2.1试剂和材料593.2.2实验步骤59-633.3结果与讨论63-773.3.1检测原理及验证6

2.2 实验部分52-54

2.1 实验材料与仪器52-53

2.2 实验步骤53-54

2.3 结果与讨论54-57

2.3.1 T4 DNA连接酶连接产物浅析54-55

2.3.2 电泳条件优化55-56

2.3.3 RCP凝胶电泳分离56

2.3.4 双引物RCA产物凝胶电泳分离56-57

2.4 小结57-58

第三章 HPV-18基因检测58-80

3.1 引言58-59

3.2 实验部分59-63

3.

2.1 试剂和材料59

3.

2.2 实验步骤59-63

3.3 结果与讨论63-77

3.1 检测原理及验证63-66

3.2 RCA-MPA原理66-67

3.3 连接酶的选择67-68

3.4 影响磁珠聚集的因素68-74

3.5 RCA-MPA策略的特异性74-76

3.6 实际样品的检测76-77

3.4 小结77-78

3.5 参考文献78-80

附录Ⅰ80-81
附录Ⅱ81-83
附录Ⅲ83