试论转基因4种转基因玉米液相芯片检测策略建立

论文导读：液相芯片论文检测论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-4Abstract4-6目录6-8第1章前言8-251转基因作物的探讨近况8-91.1转基因生物的基本概念81.2转基因作物进展态势8-92转基因作物的生物安全性及产品的标识管理9-13

2.1转基因作

摘要：近年来,随着生物技术的进展,转基因作物的种植面积大幅度增加,其安全性受到公众的广泛关注。一些国家要求检测是否含有转基因成分,有的还需要确定属于哪个转基因品系。转基因玉米是世界第二大种植作物,目前我国许可进口的转基因玉米品系有12种,主要用于加工原料,是转基因玉米中的代表品系。由此,加强对转基因作物及其产品的检测显得非常重要。目前,针对转基因作物的检测主要是以PCR为基础的核酸检测和蛋白质检测,近年来广泛利用的主要是基因芯片和实时荧光定量(Real-time PCR)检测,但由于转基因作物种类多、数量大,且一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后,转基因成分部分或者全部降解,以而使得检测难度加大。由此,建立更加先进、快速、高通量的检测策略已迫在眉急。液相芯片是近几年进展起来的一种新型的高通量检测技术平台,该策略具有准确性高、耗时短、操作简便、高通量检测的优点,适合对多种转基因作物进行快速检测。本探讨选取常见的4种转基因玉米,Bt176、Bt11、NK603和MON810为探讨对象,通过查阅NCBI数据库,找出4种转基因玉米外源基因与玉米基因组的连接序列,同时以玉米特异性Zein内源基因序列作为参照,运用DNA star、Primer5.0、DNA MAN和Primer Express3.0等分子生物学软件浅析、设计并筛选了5对特异性引物和5条特异性探针。经合成后,用特异性引物扩增目的基因序列,同时将探针与荧光编码微球偶联,之后将偶联微球的探针与扩增的目的PCR产物杂交,最终用液相芯片检测仪(Bio-plex200)检测荧光信号。并分别构建了针对5种目的基因的克隆质粒DNA,通过测序进行鉴定,将测序结果与NCBI序列比对,结果证实序列相似度基本达100%,确保后续试验的准确进行。本探讨通过对不对称PCR扩增中上下游引物比例、杂交系统中PCR产物加入量、杂交温度和杂交时间进行优化,建立了一种可以同时检测4种转基因玉米的液相芯片检测策略。该策略操作快速,在2h内即可完成整个实验。实验结果表明,针对5种目的基因的5条特异性探针均得到了较好的杂交结果,且相互之间无交叉反应,特异性强；利用该策略对不同含量的转基因玉米DNA进行检测,检测极限达0.01%,具有极高的检测灵敏度；并对该策略的重复性进行验证,结果表明变异系数均在8%以内,具有良好的重复性。本探讨建立的4种转基因玉米液相芯片检测策略,可以直接对转基因玉米进行品系特异性检测,最终确定样本中是否含有目的品系。本探讨是针对转基因玉米及其产品液相芯片检测技术的一种初步探讨,此策略为开展其它品系玉米、大豆、水稻等转基因作物的检测,建立液相芯片技术检测系统奠定了基础,搭建了很好的检测平台。关键词：转基因玉米论文不对称PCR论文液相芯片论文检测论文
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Abstract4-6
目录6-8
第1章 前言8-25
1 转基因作物的探讨近况8-9

1.1 转基因生物的基本概念8

1.2 转基因作物进展态势8-9

2 转基因作物的生物安全性及产品的标识管理9-13

2.1 转基因作物的安全性不足10-11

2.2 转基因产品的标识管理11-13

3 转基因作物的检测策略探讨13-23

3.1 蛋白质检测策略探讨13-15

3.2 核酸检测策略探讨15-19

3.3 xMAP液相芯片19-23

3.4 其它检测策略探讨23

4 本探讨的目的和作用23-25
第2章 转基因玉米液相芯片检测策略探讨25-58
1 实验材料25-28

1.1 植物材料25

1.2 实验试剂25

1.3 主要仪器及设备25-26

1.4 主要试剂的配制26-28

2 实验策略28-38

2.1 植物基因组DNA的提取及浓度测定28-29

2.2 引物、探针的设计与合成29-30

2.3 引物、探针的稀释30

2.4 单重PCR扩增30

2.5 PCR产物的回收纯化30-32

2.6 目的基因克隆与阳性质粒的构建、测序32-33

2.7 探针与微球的偶联33

2.8 探针偶联效率的验证33-34

2.9 不对称PCR系统的建立及优化34

2.10 液相芯片检测仪的利用和结果论文导读：致谢68上一页12

判定标准34-35

2.11 杂交及检测35

2.12 液相芯片杂交条件的优化35-36

2.13 五种目标基因液相芯片检测系统的建立36

2.14 特异性实验36-37

2.15 灵敏度实验37

2.16 重复性实验37-38

3 结果与浅析38-53

3.1 引物的设计与评价38

3.2 特异性引物的PCR检测结果38-41

3.3 目的基因阳性质粒的制备与鉴定41-43

3.4 色标微球上探针偶联效率的验证43-46

3.5 液相芯片各个条件优化结果46-49

3.6 液相芯片检测系统的建立49-50

3.7 特异性试验50-51

3.8 灵敏度试验51-52

3.9 重复性试验52-53

4 讨论53-58

4.1 引物和探针的设计是液相芯片的关键54-55

4.2 探针与微球的有效偶联是液相杂交的前提55

4.3 液相芯片杂交条件的优化55-56

4.4 芯片制备的质量制约是液相芯片技术的主要保证56

4.5 液相芯片检测结果的判定标准及原则56

4.6 液相芯片检测系统的重复性、特异性和敏感性验证56-58

第3章 结论与小结58-60

3.1 结论58

3.2 革新点58-59

3.3 展望59-60

参考文献60-67
附录：在读期间发表的学术论文及探讨成果67-68
致谢68