研究李斯特单核细胞增生李斯特菌超氧化物歧化酶在菌膜形成中功能剖析学术

论文导读：
摘要：单核细胞增生李斯特菌是一种常见的食源性致病菌，可以引起人类的李氏杆菌病。它在自然界中分布广泛，并可在食品加工设备上形成菌膜。菌膜是微生物粘附在介质表面形成的大量细菌群居的一种存活状态。菌膜状态下的单核细胞增生李斯特菌对消毒剂等逆境的抗性显著增强，由此会增加食品反复被污染的几率，对公共卫生和人类健康带来严重危害。揭示单核细胞增生李斯特菌的菌膜形成机制对防止和制约它的危害具有重要作用。本实验室前期构建了Tn917插入单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes4b G）基因组的突变子库，以中筛选到了菌膜形成能力增加的突变株LM-49，并确定了插入位点为lm.G_1771基因（编码一个假定的ABC转运子透性酶）。通过基因芯片和双向电泳技术，筛选野生型G和lm.G_1771基因缺失突变株（Δ1771）的差别表达基因和蛋白，发现超氧化物歧化酶（SOD）的表达量在Δ1771突变株中显著升高。本论文在此基础上对单核细胞增生李斯特菌sod基因与lm.G_1771基因的相互联系及在菌膜形成中的作用进行了探讨，并探究了抗氧胁迫相关基因与菌膜形成之间的联系，主要探讨内容和结果如下：1、同源重组载体的构建与突变株的筛选。（1）sod基因两端的同源臂连接于温敏型穿梭质粒pKSV7（含氯霉素抗性基因）中，成功构建了sod基因的同源重组载体pKSV7::sod14。（2）重组质粒分别电转化于感受态细胞G和Δ1771中，得到阳性转化子，经过双交换和抗性筛选得到sod基因单缺失突变株Δsod和lm.G_1771、sod双缺失突变株Δ1771Δsod，重组几率分别为0.46%（2/436）和0.38%（5/1300）。突变株的获得为深入探讨SOD的功能以及与lm.G_1771的联系提供了必要的材料。2、lm.G_1771基因与sod基因表达的相互影响。首先分别培养制备游离状态和菌膜状态的细胞，再利用RT-qPCR技术和酶谱浅析技术测定野生型菌株G和Δ1771中的SOD表达量。结果显示，在游离状态下，Δ1771中的sod表达量与野生型相比没有发生显著变化；菌膜状态下，基因sod在Δ1771中的表达量提升了2.2倍，SOD的酶活增加了2.3倍。同时，菌膜状态下lm.G_1771基因在Δsod突变株与野生型菌株G中的表达量无显著差别。该结果表明，菌膜状态下lm.G_1771基因的缺失会使sod的表达量增加，但在游离状态下这种作用不显著；此外，菌膜状态下sod的缺失对lm.G_1771基因的表达无显著影响。3、SOD在菌膜形成中的生理功能及其同lm.G_1771的联系。首先，利用96孔板结晶紫染色法和荧光显微镜对野生型菌株G和三株突变株（Δ1771，Δsod和Δ1771Δsod）的菌膜形成能力进行评定。其次，对这四株菌的生长能力、活性氧组分（ROS）产量和抗氧胁迫能力进行了比较。结果显示：（1）与Δ1771菌膜形成能力增强相反，Δsod和Δ1771Δsod的菌膜形成能力均显著下降，尤其是Δ1771Δsod减少地更显著；（2）Δ1771与野生型G的生长能力无显著区别，Δsod和Δ1771Δsod生长减慢并且培养相同时间形成的菌落显著偏小；（3）Δ1771与野生型G的ROS产量无显著差别，Δsod和Δ1771Δsod的ROS产量显著升高，尤其是在Δ1771Δsod中升高的更多；（4）Δ1771对氧化剂紫晶（methyl viologen, MV）的敏感性与野生型G相似，Δsod和Δ1771Δsod对MV体现出高度敏感性，并且Δ1771Δsod比Δsod对紫晶的敏感性还要强。上面陈述的结果表明，SOD作为重要的抗氧胁迫酶在维持细胞生长中起到重要作用，它可以抑制细胞过量ROS的产生，对菌膜形成起到正调控作用。并且，SOD可以与lm.G_1771一起调控菌膜的形成，两者在抵御氧胁迫中具有协同作用。4、氧化剂MV（ROS产生诱导剂）对菌膜形成的影响。选取5种血清型共10株单核细胞增生李斯特菌野生型菌株，分别对它们在TSB培养基和TSB+MV培养基中的菌膜形成能力进行比较。结果显示，1mM MV可以显著抑制菌膜的形成，并影响该菌在玻片上的聚集，表明ROS不利于菌膜的形成。该结果为SOD通过抑制ROS的产生来调控菌膜形成的这一假说提供了辅证。5、双向电泳（2-论文导读：1.4.5菌膜与氧胁迫的联系45-461.5探讨的目的、作用及思路46-48第二章SOD缺失突变株的构建48-672.1材料48-512.1.1菌株与质粒482.1.2主要培养基配制48-492.1.3主要试剂49-502.1.4仪器设备50-512.2实验策略51-572.2.1单核细胞增生李斯特菌DNA的提取512.2.2质粒的提取与纯化51-522.2.3同源重组片段引物设计及扩增
DE）及质谱联用鉴定SOD调控的蛋白。运用PDQuest8.0软件对野生型和Δsod突变株的双向电泳结果进行浅析，共找到差别表达2倍以上的蛋白14个，其中10个在Δsod中下调，4个在Δsod中上调。下调的蛋白涉及细胞调节子、代谢、生长和压力反应相关的酶类；上调的蛋白涉及代谢和细胞壁合成相关的酶类；并且部分差别蛋白在菌膜形成中起到重要作用。这些结果暗示了SOD在生长和抗性方面可能的作用方式，推测了SOD正调控菌膜形成的途径。6、利用RT-qPCR技术浅析抗氧胁迫相关基因在不同状态及不同突变株中的表达。探讨涉及的抗氧胁迫相关基因共分为三类：直接参与抗氧胁迫的基因（kat和fri）；抗氧胁迫基因表达的反应调节子（perR和sigB）；氧化损伤DNA修复基因（recA）。结果显示：（1）游离状态下，Δ1771和Δsod中抗氧胁迫基因和反应调节子的表达均比野生型要低，表明lm.G_1771和sod对这些基因均有正调控作用，并且这两个基因不影响recA的表达；但在双突变株Δ1771Δsod中，recA基因的表达量显著升高，由于recA具有启动SOS来维持存活的功能，表明了sod基因和lm.G_1771基因在共同维持细胞的正常生长中起到重要作用。（2）菌膜的形成会导致部分抗氧胁迫基因的上调，尤其在sod缺失突变株中，表明了菌膜的形成有利于抗氧胁迫缺陷菌株抗氧能力的修复。（3）MV可以刺激机体产生过量的内源性ROS，在MV的作用下，所探讨的目的基因在野生型G中均被诱导上调，表明菌膜中形成的氧胁迫适应机制比起单纯的氧化剂刺激引起的适应机制复杂得多。综上所述，ROS可以抑制菌膜的形成，菌膜的形成需要氧胁迫相关基因的参与。SOD可以消除机体代谢产生的过量ROS，抵御氧胁迫的损伤，影响抗性、代谢和生长相关酶类的表达，维持细胞的正常生长和菌膜的形成。并且，在菌膜形成中SOD的表达会受到lm.G_1771的影响，在抗氧胁迫中两者体现出协同效应。总之，SOD可与lm.G_1771基因编码的ABC转运子透性酶一起调控菌膜的形成，在菌膜形成中起到重要作用。关键词：菌膜论文单核细胞增生李斯特菌论文超氧化物歧化酶论文ABC转运子透性酶论文活性氧组分论文氧胁迫论文
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ABSTRACT8-21
符号说明21-23
第一章 文献综述23-48

1.1 单核细胞增生李斯特菌生理特点23-26

1.1 单核细胞增生李斯特菌的生物学特点23-24

1.2 单核细胞增生李斯特菌的流行病学24

1.3 单核细胞增生李斯特菌的致病机理24-26

1.2 细菌菌膜形成机制及菌膜特点26-33

1.2.1 细菌菌膜定义26-27

1.2.2 细菌粘附27-29

1.2.3 群体感应29-30

1.2.4 胞外多糖30-31

1.2.5 菌膜解体31-32

1.2.6 菌膜特点及抗性机理32-33

1.3 单核细胞增生李斯特菌菌膜探讨近况33-42

1.3.1 菌膜培养与观察策略33-35

1.3.2 影响单核细胞增生李斯特菌菌膜形成的因素35-38

1.3.3 菌膜形成相关基因的确定38-39

1.3.4 菌膜形成相关基因汇总39-42

1.4 氧胁迫与菌膜形成的分子机制42-46

1.4.1 氧胁迫的产生42

1.4.2 氧胁迫的危害42-43

1.4.3 抗氧胁迫系统43-44

1.4.4 超氧化物歧化酶44-45

1.4.5 菌膜与氧胁迫的联系45-46

1.5 探讨的目的、作用及思路46-48

第二章 SOD 缺失突变株的构建48-67

2.1 材料48-51

2.

1.1 菌株与质粒48

2.

1.2 主要培养基配制48-49

2.

1.3 主要试剂49-50

2.

1.4 仪器设备50-51

2.2 实验策略51-57

2.1 单核细胞增生李斯特菌 DNA 的提取51

2.2 质粒的提取与纯化51-52

2.3 同源重组片段引物设计及扩增52-53

2.4 同源重组质粒的构建53-55

2.5 重组质粒电转化单核细胞增生李斯特菌感受态细胞55-56

2.6 基因缺失突变株的筛选与鉴定56-57

2.3 结论文导读：.3基因sod在Δ1771中的转录水平表达78-793.3.4SOD在Δ1771中的酶谱浅析79-803.3.5lm.G_1771在Δsod中的转录水平表达803.4小结与讨论80-82第四章SOD在菌膜形成中的作用及功能浅析82-974.1材料82-844.1.1菌株824.1.2培养基82-834.1.3主要试剂834.1.4仪器设备83-844.2策略84-864.2.1单核细胞增生李斯特菌的
果与浅析57-64

2.3.1 同源重组质粒 pKSV7::sod14 的构建与鉴定57-60

2.3.2 SOD 缺失突变株的构建60-64

2.4 小结与讨论64-67

2.4.1 载体构建64-65

2.4.2 电转感受态细胞制备65

2.4.3 电转条件65-66

2.4.4 同源重组突变株的筛选66-67

第三章 ABC 转运子透性酶与 SOD 的相互联系67-82

3.1 材料67-70

3.

1.1 菌株和质粒67

3.

1.2 主要培养基配制67

3.

1.3 主要试剂67-69

3.

1.4 仪器设备69-70

3.2 策略70-76
3.

2.1 单核细胞增生李斯特菌的培养70

3.

2.2 总 RNA 的提取与鉴定70-71

3.

2.3 DNA 的去除与检测71-72

3.

2.4 cDNA 的反转录反应72

3.

2.5 引物设计与优化72-74

3.

2.6 RT-qPCR 浅析相关基因的表达74

3.

2.7 数据处理与浅析74-75

3.

2.8 单核细胞增生李斯特菌细胞总蛋白的提取75

3.

2.9 蛋白质含量的测定75-76

3.

2.10 非变性凝胶电泳的 SOD 酶谱浅析76

3.3 结果与浅析76-80

3.1 总 RNA 的提取及纯度浅析76-78

3.2 RT-qPCR 相关引物的设计与优化78

3.3 基因 sod 在Δ1771 中的转录水平表达78-79

3.4 SOD 在Δ1771 中的酶谱浅析79-80

3.5 lm.G_1771 在Δsod 中的转录水平表达80

3.4 小结与讨论80-82

第四章 SOD 在菌膜形成中的作用及功能浅析82-97

4.1 材料82-84

4.

1.1 菌株82

4.

1.2 培养基82-83

4.

1.3 主要试剂83

4.

1.4 仪器设备83-84

4.2 策略84-86
4.

2.1 单核细胞增生李斯特菌的活化84

4.

2.2 菌膜形成能力测定84-85

4.

2.3 生长曲线测定85

4.

2.4 生长能力观测85

4.

2.5 ROS 测定85

4.

2.6 抗氧胁迫(MV)能力测定85-86

4.

2.7 氧化剂 MV 对菌膜形成的影响86

4.3 结果与浅析86-95
4.

3.1 野生型与突变株的菌膜形成能力评价86-88

4.

3.2 野生型与突变株的生长能力评价88-89

4.

3.3 野生型与突变株 ROS 产量的比较89-90

4.

3.4 野生型与突变株抗 MV 能力比较90-92

4.

3.5 氧化剂 MV 对单核细胞增生李斯特菌菌膜形成的影响92-95

4.4 小结与讨论95-97

4.1 SOD 正调控菌膜的形成及与 ABC 转运子透性酶的联系95-96

4.2 氧化剂 MV 对菌膜形成的抑制作用96-97

第五章 双向电泳鉴定 SOD 影响的蛋白97-122

5.1 材料97-102

5.

1.1 菌株和质粒97

5.

1.2 主要培养基的配制97

5.

1.3 主要试剂97-101

5.

1.4 仪器设备101-102

5.2 策略102-108
5.

2.1 单核细胞增生李斯特菌总蛋白的提取102

5.

2.2 总蛋白的沉淀102-103

5.

2.3 蛋白质含量的测定103

5.

2.4 IPG 胶条 pH 范围选择103

5.

2.5 双向电泳技术及操作103-106

5.

2.6 胶体考染蛋白凝胶106-107

5.

2.7 蛋白 2-DE 图谱差别蛋白点浅析107

5.

2.8 质谱浅析及数据检索107

5.

2.9 RT-qPCR 浅析相关蛋白的表达107-108

5.3 结果与浅析108-115
5.

3.1 蛋白定量结果108-109

5.

3.2 IPG 胶条 pH 范围的确定109-110

5.

3.3 总蛋白质沉淀策略的确定110

5.

3.4 野生型 G 和Δsod 突变株总蛋白 2-DE 比较110-112

5.

3.5 野生型 G 和Δsod 突变株差别蛋白的鉴定112-114

5.

3.6 SOD 对信号分子表达的影响114-115

5.4 小结与讨论115-122
5.

4.1 Δsod 中表达量下降的蛋白115-118

5.

4.2 Δsod 中表达量增加的蛋白118-119

5.

4.3 SOD 对菌膜形成的调控途径119-122

第六章 氧胁迫相关基因在野生型和突变株中的表达122-139

6.1 材料122-124

6.

1.1 菌株122

6.

1.2 培养基122-123

6.

1.3 主要试剂123

6.1.4 仪论文导读：NA中DNA的去除与检测1256.2.5cDNA的反转录合成1256.2.6氧胁迫相关基因的选取与引物设计1256.2.7RT-qPCR浅析氧胁迫相关基因的表达1256.2.8数据处理与浅析1256.3结果与浅析125-1336.3.1菌膜状态总RNA的提取与反转录125-1266.3.2氧胁迫条件下总RNA的提取与反转录126-1276.3.3氧胁迫相关基因扩增效率计算1276.
器设备123-124

6.2 策略124-125

6.

2.1 菌膜状态和游离状态细胞的培养与收集124-125

6.

2.2 常规培养与氧胁迫条件下细胞的培养与收集125

6.

2.3 总 RNA 的提取与鉴定125

6.

2.4 总 RNA 中 DNA 的去除与检测125

6.

2.5 cDNA 的反转录合成125

6.

2.6 氧胁迫相关基因的选取与引物设计125

6.

2.7 RT-qPCR 浅析氧胁迫相关基因的表达125

6.

2.8 数据处理与浅析125

6.3 结果与浅析125-133
6.

3.1 菌膜状态总 RNA 的提取与反转录125-126

6.

3.2 氧胁迫条件下总 RNA 的提取与反转录126-127

6.

3.3 氧胁迫相关基因扩增效率计算127

6.

3.4 菌膜形成对氧胁迫相关基因表达的影响127-128

6.

3.5 MV 对氧胁迫相关基因表达的影响128-129

6.

3.6 lm.G_1771 和 sod 对氧胁迫相关基因表达的影响129-133

6.4 小结与讨论133-139
6.

4.1 氧胁迫相关基因在菌膜形成和抗 MV 方面的作用133-136

6.

4.2 lm.G_1771 和 sod 对氧胁迫相关基因表达的影响136

6.

4.3 SOD 正调控菌膜形成的作用机理136-139

第七章 结论与展望139-141

7.1 主要结论139

7.2 特点和革新139-140

7.3 展望140-141

参考文献141-158
附录 1158-159
附录 2159-161
致谢161-163
攻读学位期间已发表和准备中的学术论文163-165