试述表达鸡MHCⅠα基因真核表达系统建立与鉴定

论文导读：和鼠等哺乳动物的MHC分子结构和功能的探讨较多,而鸡的MHC分子探讨相对较落后，尤其是MHCI类分子。为了对鸡的MHCⅠ类分子的进一步探讨，本试验构建稳定表达鸡MHCI类分子α基因的P815细胞株。首先，本探讨根据GenBank登录的鸡MHCⅠα基因全序列(GenBank登录号:AY989897)和pEGFP-N1的多克隆位点序列，设计一对引物。以鸡的外周血单
摘要：主要组织相容性复合体（Majorhistocompatibiptycomplex,MHC）在免疫应答中起重要作用。鸡的主要组织相容性复合体I(BF)又名B复合体,位于16号染色体,由主基因座(BF2)和次基因座(BF1)组成。鸡的B-F区的基因编码与哺乳动物同源的MHCI类分子。MHCI类分子主要负责递呈内源性抗原肽，被CD8+T细胞识别。F2基因编码的MHCI类分子α链在递呈内源性抗原中起重要作用。由于MHC在动物机体免疫系统中的重要作用而成为抗病能力的候选标记基因。MHC的特殊性质及其重要的功能，使得其在免疫遗传学、群体遗传学和抗病育种学等许多领域具有独特的效力。人和鼠等哺乳动物的MHC分子结构和功能的探讨较多,而鸡的MHC分子探讨相对较落后，尤其是MHCI类分子。为了对鸡的MHCⅠ类分子的进一步探讨，本试验构建稳定表达鸡MHCI类分子α基因的P815细胞株。首先，本探讨根据GenBank登录的鸡MHCⅠα基因全序列(GenBank登录号:AY989897)和pEGFP-N1的多克隆位点序列，设计一对引物。以鸡的外周血单核细胞抽提mRNA，作为RT-PCR扩增MHCⅠα基因片段的模板。通过大量PCR获得鸡MHCⅠα基因片段，将其插入能够表达绿色荧光蛋白的载体pEGFP-N1获得真核重组质粒pEGFP-N1-MHCⅠα。经过用卡那霉素的筛选，以及EcorI、SalI双酶切和PCR初步鉴定正确后，送上海生工进行测序鉴定。其次，为了了解哺乳动物MHCⅠα和禽类MHCⅠα之间的区别和联系，我们通过生物信息学对鸡、鹌鹑、鸭、小鼠、人、牛进行序列比对和绘制进化树，结果表明禽类与哺乳类MHCⅠα链在进化上属于不同的分支，鹌鹑与鸡的亲缘距离最近，其次是鸭，小鼠、人、牛则为一类。进行鸡、鸭、鼠、人蛋白结构预测发现它们具有高度的结构相似性，由此我们推测它们的功能也是及其类似的。通过软件对鸡的MHCⅠα编码的蛋白进行细胞内定位预测，结果是蛋白分布于内膜系统。最后，将重组质粒pEGFP-N1-MHCⅠα转染COS-7细胞，观察MHCⅠα的瞬时表达特性和细胞定位情况，经24h培养后在荧光显微镜下观察，MHCⅠα基因表达的鸡MHCI类分子的α链定位于内膜系统，结果和预测的一样即蛋白表达在内膜系统。通过试验确定G418工作浓度，在P815细胞密度为70%-90%时，将pEGFP-N1-MHCⅠα重组质粒转染到P815细胞中，然后进行筛选获得了抗600μg／mlG418的P815细胞株。经过RT-PCR的鉴定，表明MHCⅠα已稳定的在P815中稳定表达。经过反复冻存、复苏，传代培养。P815（pEGFP-N1-MHCⅠα）细胞仍保持G418抗性，RT-PCR检测阳性，表明所得到P815（pEGFP-N1-MHCⅠα）细胞株具有稳定性，适用于下游实验。用荧光显微镜进行观察发现P815的pEGFP-N1-MHCⅠα的荧光定位于细胞的内膜系统。在前人的探讨基础以及预测结果和实验结果我们可确定鸡MHCⅠα定位于细胞的内膜系统。本实验成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-MHCⅠα，并获得了稳定表达鸡MHCⅠα基因的P815细胞株，为探讨MHCⅠ分子在抗肿瘤中的作用建立了细胞模型，也为进一步探讨鸡的MHCⅠ分子的结构和功能奠定基础。关键词：MHCⅠα论文稳定表达论文G418论文P815论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-5
Abstract5-7
目录7-9
图表目录9-10
缩略词表10-11
文献综述11-21
1 MHC的探讨背景11-12
2 鸡MHC分子结构与分布12-15

2.1 鸡MHCI类(B-F)分子结构与分布13

2.2 鸡MHCⅡ类(B-L)分子结构与分布13-14

2.3 鸡MHCIV类(B-G)分子结构与分布14-15

3 MHC的遗传学特点15-16

3.1 鸡MHC分子的多态性15

3.2 鸡MHC分子单元型遗传15-16

3.3 鸡MHC分子连锁不平衡16

4 鸡MHCⅠ的生物学功能16-18

4.1 参与抗原的加工与呈递16-17

4.2 参与免疫细胞间限制性识别17

4.3论文导读：473.7细胞株的运用展望47-48结论48-49参考文献49-55致谢55-56作者介绍56上一页12
参与T细胞分化历程17-18
5 鸡MHCⅠ分子与疾病的联系18-19

5.1 鸡MHCⅠ分子与马立克氏病（MD）抗性相关性18

5.2 鸡MHCⅠ分子与鸡劳氏瘤病(Rous sarcoma,RS)抗性相关性18-19

5.3 鸡MHCⅠ分子与细菌性疾病的抗性相关性19

5.4 MHC分子与疾病联系的四种机制19

6 展望19-20
7 探讨的目的和作用20-21
引言21-22
1 材料与策略22-34

1.1 实验材料22-24

1.2 实验策略24-34

2 结果与浅析34-43

2.1 鸡MHCⅠα基因PCR扩增和检测34-35

2.2 重组质粒pEGFP-N1-MHCⅠα的双酶切与PCR鉴定35

2.3 pEGFP-N1-MHCⅠα和pEGFP-N1的浓度测定35-36

2.4 禽类和哺乳类MHCⅠα蛋白质序列的特点36-38

2.5 不同物种的MHCⅠα蛋白质结构的预测38-39

2.6 鸡MHCⅠα细胞内定位特性的预测39-40

2.7 重组质粒的瞬时转染40-41

2.8 G418筛选工作浓度筛选41

2.9 表达MHCⅠα基因阳性株细胞的鉴定41-42

2.10 P815（pEGFP-N1-MHCⅠα）细胞株稳定性的鉴定结果42-43

3 讨论43-48

3.1 重组质粒的构建43-44

3.2 G418浓度的确定44

3.3 P815细胞的培养44-45

3.4 重组质粒的转染45-46

3.5 细胞株的鉴定46

3.6 生物信息学浅析46-47

3.7 细胞株的运用展望47-48

结论48-49
参考文献49-55
致谢55-56
作者介绍56