谈细胞降钙素基因相关肽对成骨样细胞与血管内皮细胞交互作用调控机制生

论文导读：验检测，ELISA检测共培养环境对MG-63细胞OC表达转变影响。4.CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞分化的生物学作用：4.1CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞CollagenⅠmRNA表达的作用：以量效组100nM，10nM，1nM和0.1nM，和时效组0h，24h，48h，72h和96h分组，CGRP干预MG-63-HUVECs共培养系统，获取MG-63细胞mRNA，RealtimePCR检测各组细胞C
摘要：骨折修复重建历程中，再生神经和血管系统对骨痂发挥了严密的、实时的调控作用，相互协调，最终完成骨痂的结构和功能重建。周围神经所分泌的神经肽类物质，降钙素基因相关肽(calcitonin gene related protein，CGRP)，在骨折修复历程中发挥了推动骨痂生成的生物学作用。体外环境下CGRP能够推动成骨细胞增殖，并证明成骨细胞表面有CGRP受体的有着，大量下游细胞信号通路得到证实。但细胞实验探讨中，多数实验仅围绕CGRP对成骨细胞(Osteoblasts, OB)或破骨细胞(Osteoclasts, OC)等单一成骨相关细胞展开，而对多细胞间的交互调控作用(Cross-talk)探讨较少，由此未能全面完整地说明CGRP在体内多细胞环境下的促成骨机制。成骨细胞和血管内皮细胞(Vascular endothepal cells, VECs)之间有着一种相互影响、相互调控的OB-VECs间cross-talk机制。在骨痂中VECs不仅仅构建了微血管簇为骨痂提供了营养支持，还作为一种具有成骨诱导功能细胞，参与了MSCs的募集和诱导分化。探讨发现细胞间cross-talk主要发生在两个层面，一是经由细胞膜之间的蛋白完成细胞与细胞间的直接作用，二是通过自分泌和旁分泌的方式完成细胞间的间接作用。而在骨折愈合历程中，骨痂中的CGRP阳性纤维沿着血管生长，并且有大量的体外实验证实，CGRP在血管再生和形成中也发挥着重要的生物学作用，说明CGRP参与了对OB-VECs之间Cross-talk的调控。基于骨痂中的CGRP对成骨的调控机制可能与VECs细胞相关这一推测，本实验依据课题组的前期预实验结果，建立CGRP干预的OB-VECs共培养系统体，通过对VECs细胞旁分泌成骨因子的检测，和OB细胞对应因子受体表达及细胞分化指标的检测，探讨CGRP对OB-VECs间cross-talk的调控机制。以而在体内及体外多细胞环境下，发现并证实神经通过对VECs旁分泌的调控作用发挥了促成骨效应，进一步阐述骨痂中神经对血管和成骨交互调控的作用机制。策略：1.细胞培养：美国ATCC公司人脐静脉血管内皮细胞HUVECs和人骨肉瘤细胞MG-63细胞株，加入含10%FCS的高糖DMEM培养基，以5×106/瓶密度接种于100ml培养瓶中，置于5%CO2孵箱中37°C孵育72或96h传代，培养传代，6-8代细胞用于共培养实验。2、共培养系统建立：2.1直接共培养：MG-63和HUVECs细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％FCS的DMEM培养液配制成单个细胞悬液，按照不同混合比例的细胞悬液以1×105个/孔密度接种到12孔板，培养后24h后将细胞至于倒置显微镜下进行观察。2.2间接共培养：将MG-63细胞以5×105浓度接种于12孔板，安装0.4μm孔径的12孔板Transtwell小室，将HUVECs细胞以5×105浓度接种于Transtwell小室内。3.间接共培养环境下MG-63细胞的分化：3.1MG-63细胞CollagenⅠ mRNA检测：间接培养24h，48h，72h和96h后，提取MG-63细胞mRNA用于实验检测。Real time PCR检测共培养环境对MG-63细胞CollagenⅠmRNA表达转变影响；3.2培养液中OC检测：间接培养24h，48h，72h和96h后，提取培养液于实验检测，ELISA检测共培养环境对MG-63细胞OC表达转变影响。4. CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞分化的生物学作用：4.1CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞CollagenⅠ mRNA表达的作用：以量效组100nM，10nM，1nM和0.1nM，和时效组0h，24h，48h，72h和96h分组，CGRP干预MG-63-HUVECs共培养系统，获取MG-63细胞mRNA，Real timePCR检测各组细胞CollagenⅠmRNA表达差别。4.2CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞OC表达的作用：以量效组100nM，10nM，1nM和0.1nM，和时效组0h，24h，48h，72h和96h分组，CGRP干预MG-63-HUVECs共培养系统，获取MG-63细胞培养液，ELISA检测各组细胞OC表达差别。5.共培养系统中CGRP所诱导的论文导读：VECs间接共培养系统，作用0h，12h，24h，36h，和48h后收集细胞培养液或细胞，进行ELISA和RealTime-PCR测定。5.2共培养系统中CGRP所诱导的MG-63细胞VEGF受体的表达变化：将MG-63与HUVECs细胞Transtwell小室内间接共培养，未加Transtwell小室的MG-63培养为空白对照组(CON)，单独培养加入10nMCGRP的为CGRP作用组(CGRP)；加入Transwell及
VEGF调控机制：5.1共培养系统中CGRP所诱导的VEGF-A分泌变化：10nM的CGRP作用于MG-63、HUVECs和MG-63-HUVECs间接共培养系统，作用0h，12h，24h，36h，和48h后收集细胞培养液或细胞，进行ELISA和Real Time-PCR测定。5.2共培养系统中CGRP所诱导的MG-63细胞VEGF受体的表达变化：将MG-63与HUVECs细胞Transtwell小室内间接共培养，未加Transtwell小室的MG-63培养为空白对照组(CON)，单独培养加入10nM CGRP的为CGRP作用组(CGRP)；加入Transwell及HUVECs的为共培养组(CO)，同时加入CGRP干预的为实验组(EXP)。培养48h后对MG-63细胞的VEGFR1/2进行免疫荧光检测。结果：1. MG-63-HUVECs细胞共培养：1.1直接共培养： MG-63和HUVECs细胞按照1:4，1:2，1:1，2:1和4:1比例进行共培养，24h发现MG-63：HUVECs按照比例为1:1的直接共培养系统中两种细胞生长最为良好，细胞间杂生长，其中HUVECs细胞呈结节样生长，MG-63细胞生长于内皮细胞结节周围。DiI荧光标记后，MG-63-HUVECs共培养系统24h，HUVECs细胞呈结节样生长，MG-63细胞生长于内皮细胞结节周围，48h，HUVECs细胞结节形成细胞坏死，72h，HUVECs细胞与MG-63细胞分层，MG-63细胞向内皮细胞结节内浸润生长，96h，HUVECs细胞出现类管型样结构，MG-63细胞完全布满培养瓶底。1.2间接共培养对MG-63细胞分化的作用：MG-63细胞在与HUVECs细胞间接共培养环境下，其CollagenⅠ mRNA表达显著增加，24h共培养组MG-63细胞所表达的CollagenⅠ mRNA为对照组的1.32，(P0.05)；48h达到最大值，为对照组的1.57，(P0.01)。培养液中OC表达随时间增加，且共培养组显著高于对照组，24h，共培养组培养清液中OC含量为对照组的1.54，(P0.01)；48h为对照组的1.48，(P0.01)；72h为对照组1.35，(P0.05)。2. CGRP对间接共培养系统中MG-63细胞的生物学作用：不同浓度的CGRP作用MG-63-HUVECs细胞共培养系统48h后，MG-63细胞的CollagenⅠ mRNA和OC表达均有所增加，以10nM浓度组的MG-63细胞CollagenⅠmRNA和OC表达增高最为显著，分别为对照组1.94(P0.01)和2.02(P0.01)。10nM浓度CGRP作用MG-63-HUVECs细胞共培养系统，MG-63细胞CollagenⅠmRNA表达呈现增加走势，CollagenⅠ mRNA表达于48h达到峰值，为对照组的1.98，(P0.01)；培养液中的OC含量自24h后呈现增加走势(P0.01)，培养液中的OC含量于96h达到峰值，为对照组的2.91。3.共培养系统中CGRP所诱导的VEGF-A调控机制：3.1共培养系统中CGRP所诱导的VEGF-A分泌变化：在10nM CGRP的作用下，HUVECs单独作用组中培养液中VEGF-A含量相对对照组显著上升，在48h达到峰值，为对照组的2.31，VEGF-AmRNA相对对照组显著上升，在24h达到峰值，为对照组的2.71； MG-63单独作用组中培养液中的VEGF-A的含量在36h后随着时间延长出现下降，在48h达到最低值，为对照组的0.66；CGRP干预共培养组中，HUVECs细胞VEGF-A mRNA表达在24h后出现显著增高，24h达到峰值，为对照组的2.42。3.2共培养系统中CGRP所诱导的MG-63细胞VEGF受体表达变化：CGRP升高了共培养系统中MG-63细胞中VEGFR1的表达，10nM CGRP作用48h后，通过交叉比较，CO组VEGFR1表达显著高于CON组，0.186:0.124(p0.01)；EXP组VEGFR1表达显著高于CON组，0.201:0.124(p0.01)，并显著高于CGRP组，0.201:0.118(p0.01)。CGRP和共培养环境分别升高了MG-63细胞中VEGFR2的表达，10nM CPGR作用48h后论文导读：关键词：降钙素基因相关肽论文成骨细胞论文血管内皮细胞论文细胞共培养论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。缩略语表5-7Abstract7-12摘要12-16前言16-17第一章成骨样细胞-血管内皮细胞共培养系统的建立17-361.1前言17-18
，通过交叉比较，CGRP组和CO组均显VEGFR2表达著高于CON组，分别为0.177:0.081(p0.01)和0.154:0.081(p0.01)；EXP组VEGFR2表达显著高于CON组，0.194:0.081(p0.01)，并显著高于CO组，0.194:0.154(p0.05)。结论1. MG-63细胞与HUVECs细胞能够在高糖DMEM培养基中直接共培养，其中以1:1比例为优势比例；血管内皮细胞呈结节样生长，随时间延长有出现管型样结构的走势，MG-63细胞在其周围生长。2. MG-63-HUVECs间接共培养环境下，Collegen I mRNA表达和分泌型OC增加，推动MG-63细胞的分化成熟。3. CGRP对共培养系统中MG-63细胞CollagenⅠ mRNA和OC表达具有显著地推动作用，以10nM为最佳浓度，CGRP和共培养两种方式均能推动MG-63细胞CollagenⅠ mRNA和OC表达，推动MG-63细胞分化成熟。4. CGRP能够推动MG-63-HUVECs共培养系统中HUVECs细胞表达VEGF-AmRNA，上调MG-63-HUVECs共培养系统中MG-63细胞VEGFR1/2受体表达，以VEGFR2更为显著。但CGRP对MG-63-HUVECs共培养系统培养液中VEGF-A含量无显著影响。关键词：降钙素基因相关肽论文成骨细胞论文血管内皮细胞论文细胞共培养论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。缩略语表5-7
Abstract7-12
摘要12-16
前言16-17
第一章 成骨样细胞-血管内皮细胞共培养系统的建立17-36

1.1 前言17-18

1.2 实验一直接共培养18-25

1.3 实验二间接共培养25-34

1.4 讨论34-35

1.5 小结35-36

第二章 CGRP 对间接共培养系统中 MG-63 细胞的生物学作用36-49

2.1 前言36-37

2.2 材料与策略37-46

2.3 讨论46-48

2.4 小结48-49

第三章 共培养系统中 CGRP 所诱导的 VEGF 调控机制49-66

3.1 前言49-50

3.2 实验一共培养系统中 CGRP 所诱导的 VEGF 分泌变化50-59

3.3 实验二共培养系统中 CGRP 所诱导的 MG-63 细胞 VEGF 受体表达变化59-64

3.4 讨论64-65

3.5 小结65-66

全文结论66-67
参考文献67-72
文献综述 成骨细胞-血管内皮细胞共培养系统的探讨进展72-80
参考文献77-80
在读博士期间发表论文80-81
致谢81-82