研究支架热致相分离法制备组织工程血管支架及生物学评价理工

论文导读：
摘要：热致相分离技术是一种制备纳米纤维组织工程支架的有效手段,采取该技术制备的管状支架可用于小口径血管缺损的修复。但采取左旋聚乳酸(PLLA)单一材料制备的纳米纤维血管支架由于缺乏柔性和弹性,力学强度与天然血管有很大差距,无法满足临床需要。为克服这一难题,本论文采取PLLA与弹性体聚(ε一己内酯)(PCL)或左旋聚乳酸一聚ε-己内酯共聚物(PLCL,50:50)的混合系统来制备相分离管状支架。并通过交联剂将肝素与纳米纤维血管支架表面共价结合,提升支架的抗凝血能力。通过培养猪髂动脉内皮细胞(PIECs)和人血管平滑肌细胞(HVSCs)对材料的生物相容性进行评价。主要探讨分为三个部分：1.采取PLLA/PCL及PLLA/PLCL复合系统制备纳米纤维管状支架。结果显示：当PLLA/PCL混合系统进行相分离时,支架具有大孔结构,并且孔径及孔隙率随着PCL的比例的提升而增大。由于PLLA和PCL不相容,混合聚合物溶液在-80℃发生相分离。PLLA处于不稳定状态而发生旋节分解相分离,形成均一的纳米纤维结构；系统中PCL处于亚稳状态而发生成核-生长相分离,PCL形成微球并分布于PLLA的纳米纤维结构中。部分PCL微球在相分离历程中以支架中逃逸出来,使制备的纳米纤维支架具有“海岛”状结构。而在PLLA/PLCL混合系统中,由于两者具有较好的相容性,发生相分离时,能够形成均一的纳米纤维结构,由此制备的血管支架的拉伸力学性能得到很大提升。2.将PLLA/PLCL混合比例为40：60的纳米纤维管状支架进行肝素化,肝素与纳米纤维支架能够通过交联剂共价结合。由于支架表面接有肝素,提升了材料的亲水性,降低了蛋白吸附能力。通过甲苯胺蓝染色法定量浅析,得出支架上肝素的含量为3.0±0.13μg/cm2,体外凝血实验表明,表面肝素化支架提升了抗凝血能力。3.分别采取PIECs和HVSCs细胞与支架共培养,评价血管支架的生物相容性。结果表明PIECs细胞能在PLLA/PLCL支架表而增殖和生长,细胞与支架结合紧密,并且细胞形态良好。相分离纳米纤维材料能够为细胞提供更多的附着和生长位点,并能维持细胞表型。HVSCs细胞共培养结果也表明细胞能够在支架表面上粘附生长。由此,相分离制备的PLLA/PLCL小口径纳米纤维血管支架有望用于损伤血管的修复。关键词：PLLA论文PLCL论文相分离论文血管支架论文组织工程论文
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ABSTRACT7-12
1 绪论12-23

1.1 血管组织工程13-14

1.2 天然材料组织工程血管支架14-16

1.3 功能聚合物为基础的血管组织工程支架16-18

1.4 血管细胞及生长因子18-19

1.5 制备血管支架的策略19-21

1.5.1 无支架的全细胞生物血管19-20

1.5.2 静电纺丝法20

1.5.3 脱细胞血管基质20

1.5.4 快速成型法20-21

1.5.5 生物反应器的设计和组织培养的调控21

1.5.6 热致相分离/冷冻干燥21

1.6 本论文的探讨内容、革新点及作用21-23

1.6.1 探讨内容21-22

1.6.2 革新点及作用22-23

2 复合纳米纤维管状支架的制备与表征23-40

2.1 前言23-24

2.2 实验内容24-28

2.1 材料与仪器24-25

2.2 PLLA/PLCL、PLLA/PCL复合纳米纤维支架的制备25-26

2.3 形貌表征26

2.4 孔径及孔隙浅析26

2.5 力学性能测试26-27

2.6 化学结构浅析27

2.7 X射线衍射(XRD)27

2.8 热学性质浅析27-28

2.3 结果与讨论28-38

2.3.1 混合不同材料对血管支架的影响28-31

2.3.2 支架密度和孔隙率浅析31-32

2.3.3 力学测试结果浅析32-34

2.3.4 红外图谱浅析34-35

2.3.5 X-射线衍射浅析35-38

2.4 本章小结38-40

3 PLLA/PLCL复合纳米纤维血管支架的肝素化40-52

3.1 引言40-43

3.

1.1 血液凝固的原理40-41

3.1.2 血液与材料接触导致的凝论文导读：2.4细胞观察55-564.2.5消化细胞564.2.6细胞种植564.2.7黏附细胞形貌观察564.2.8细胞黏附与增殖测试56-574.2.9PIECs细胞染色及共聚焦观察574.2.10HVCs细胞染色及共聚焦观察57-584.2.11PIECs细胞特异表达蛋白染色及共聚焦观察584.3结果与讨论58-634.3.1细胞在培养板上的形貌观察58-594.3.2细胞SEM形貌观察59-604
血41-43

3.2 实验内容43-46

3.

2.1 材料与仪器43-44

3.

2.2 PLLA/PLCL40：60纳米纤维支架的肝素化44

3.

2.3 甲苯胺蓝染色测试44-45

3.

2.4 红外图谱鉴别45

3.

2.5 接触角测试45

3.

2.6 血管支架表面的肝素含量浅析45

3.

2.7 血管支架表面的蛋白吸附测试45

3.

2.8 体外抗凝血测试45-46

3.3 结果与讨论46-50

3.1 甲苯胺蓝染色浅析46

3.2 红外图谱鉴别浅析46-47

3.3 亲疏水性测试47

3.4 PLLA/PLCL40：60纳米纤维膜上肝素量的测定47-48

3.5 PLLA/PLCL40：60纳米纤维膜体外蛋白吸附测试48-49

3.6 体外抗凝血测试49-50

3.4 本章小结50-52

4 PLLA/PLCL复合纳米纤维血管支架的生物学评价52-65

4.1 前言52-53

4.2 实验内容53-58

4.

2.1 材料与仪器53-55

4.

2.2 材料准备及处理55

4.

2.3 复苏细胞55

4.

2.4 细胞观察55-56

4.

2.5 消化细胞56

4.

2.6 细胞种植56

4.

2.7 黏附细胞形貌观察56

4.

2.8 细胞黏附与增殖测试56-57

4.

2.9 PIECs细胞染色及共聚焦观察57

4.

2.10 HVCs细胞染色及共聚焦观察57-58

4.

2.11 PIECs细胞特异表达蛋白染色及共聚焦观察58

4.3 结果与讨论58-63
4.

3.1 细胞在培养板上的形貌观察58-59

4.

3.2 细胞SEM形貌观察59-60

4.

3.3 细胞增殖60-61

4.

3.4 PIECs细胞染色及共聚焦观察61-62

4.

3.5 HVCs细胞染色及共聚焦观察62

4.

3.6 PIECs特异蛋白的表达染色62-63

4.4 本章小结63-65
5 结论与展望65-67

5.1 本论文主要结论65-66

5.2 有着不足与展望66-67

参考文献67-72
附录 攻读硕士学位期间科研及发表论文情况72-73
致谢73