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简论糖苷酶蛇根木异胡豆苷糖苷酶及Vinorine合成酶表达、纯化、抑制剂抑制机理和复合物三维结构

最后更新时间:2024-02-06 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:31616 浏览:131160
论文导读:的设计与化学合成提供结构上的重要信息,同时,也能为酶结构修饰转变其底物特异性提供新型高效的生物催化剂奠定论述基础。VS酶是BAHD家族中第一个得到三维结构的酶,但其结合、活性位点及催化机理尚不确定,由此对VS酶与其底物或辅因子等的复合物三维结构剖析显得尤为重要。本论文采取突变法及重新筛选新结晶条件等手段尝试获取
摘要:蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth. ex Kurz)为夹竹桃科萝芙木属药用植物,其药用部位根含有90余种生物碱,主要活性成分包括阿吗灵、阿吗碱、利血平、瑞西那明和地舍平,有抗心律失常、降血压、镇静和止痛等作用。探讨该次生代谢产物生物合成途径是我们准确了解生物合成机理以及调控代谢方向、体外异源表达活性成分和酶修饰等的前提。本论文对参与阿吗灵生物合成途径中重要的异胡豆苷糖苷酶(Strictosidine-O-beta-D-glucosidase, SG)和Vinorine合成酶(Vinorine Synthase, VS)进行了系列探讨,主要包括酶表达、纯化、复合物结晶、三维结构表征及抑制剂抑制机理等探讨。课题组在前期对异胡豆苷糖苷酶的生物化学以及单晶的三维结构进行了探讨,通过序列比对和相关验证得出其为糖苷水解酶家族成员(Glycoside hydrolase, GH)。发现及合成潜在糖苷酶抑制剂具有重要的作用,如在人体糖尿病治疗,溶酶体存储紊乱或是病毒感染以及抑制这些糖苷酶会对代谢等产生重要影响。本论文第一部分对近年来引起广泛兴趣的糖苷酶抑制剂进行了基于酶三维结构和原子水平上的抑制机理浅析与诠释。摸索相关糖苷酶与不同抑制剂复合物的结晶条件,采取气相扩散悬滴法进行结晶,底物浸泡法获取酶与抑制剂的复合物,对所搜集数据进行浅析处理,获得酶与抑制剂的三维结构,阐明不同抑制剂的抑制机理。为进一步抑制剂的设计与化学合成提供结构上的重要信息,同时,也能为酶结构修饰转变其底物特异性提供新型高效的生物催化剂奠定论述基础。VS酶是BAHD家族中第一个得到三维结构的酶,但其结合、活性位点及催化机理尚不确定,由此对VS酶与其底物或辅因子等的复合物三维结构剖析显得尤为重要。本论文采取突变法及重新筛选新结晶条件等手段尝试获取复合物单晶,并搜集了衍射数据,经初步处理得到了不同于先前结构的晶胞构型。高通量筛选发现了三个不同的苗头结晶条件,是接下来优化及获得适合X-射线衍射的复合物单晶的前提条件。关键词:异胡豆苷糖苷酶(SG)论文Vinorine合成酶(VS)论文阿吗灵论文三维结构论文糖苷酶抑制剂论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。论文导读:酶链式反应(PCR)40-413.3琼脂糖凝胶电泳41-423.4VS蛋白基因PCR产物的TA克隆42-433.5热击型感受态细胞的制备433.6连接产物转化TOP10感受态细胞43-443.7重组克隆的鉴定44-463.8序列浅析463.9蛋白表达46-473.10蛋白质的纯化和浅析47-533.11抑制常数的测定53-543.12浅析检测策略543.13蛋白结晶54-573.14晶体X-射线衍
致谢4-5
摘要5-7
ABSTRACT7-9
缩写表9-12
20种常见氨基酸表12-17
1 探讨背景及立题依据17-32

1.1 蛇根木和阿吗灵药用探讨背景18-19

1.2 阿吗灵生物合成途径19-22

1.3 SG的探讨背景及立体依据22-27

1.4 VS的探讨背景及立题依据27-31

附31-32
2 实验材料32-39

2.1 细菌菌株32

2.2 质粒载体32-34

2.3 培养基34

2.4 主要缓冲系统34-35

2.5 主要化学试剂35-36

2.6 生物试剂36-37

2.7 仪器37-39

3 实验策略39-62

3.1 引物设计与合成39-40

3.2 聚合酶链式反应(PCR)40-41

3.3 琼脂糖凝胶电泳41-42

3.4 VS蛋白基因PCR产物的TA克隆42-43

3.5 热击型感受态细胞的制备43

3.6 连接产物转化TOP10感受态细胞43-44

3.7 重组克隆的鉴定44-46

3.8 序列浅析46

3.9 蛋白表达46-47

3.10 蛋白质的纯化和浅析47-53

3.11 抑制常数的测定53-54

3.12 浅析检测策略54

3.13 蛋白结晶54-57

3.14 晶体X-射线衍射数据收集和处理57-62

4 实验结果62-94

4.1 SG表达、纯化、结晶和结构探讨结果62-84

4.2 VS突变、表达、纯化和结晶84-94

5 讨论94-115

5.1 异胡豆苷糖苷酶讨论94-104

5.2 Vinorine合成酶讨论104-115

6 结论115-117
7 萜类吲哚生物碱生物合成及结构生物学探讨进展117-124

7.1 植物次生代谢产物117

7.2 生物碱合成途径117-119

7.3 植物生物技术与生物碱探讨119-121

7.4 分子生物学与生物碱探讨121-122

7.5 结构生物学与生物碱探讨122-123

7.6 蛋白质结构生物学123-124

参考文献124-133
附录133-138
作者简历138