研究碱基基于工具酶信号放大技术检测单碱基突变和地沟油设计

论文导读：物质进行检测，在当前生化浅析探讨中尤为重要。在本论文的探讨中，以工具酶的信号放大技术为基础，结合化学发光检测和荧光定量PCR检测技术，分别提出了对单碱基突变和地沟油快速检测的策略。其主要内容如下：1.利用链置换循环放大化学发光法检测单碱基突变本章基于链置换循环放大和磁珠分离技术建立了一种操作简便、快速，室温下可
摘要：在生化浅析中有许多待检测的物质由于其本身含量较低，无法用当前常规的策略检测出来，由此进展高灵敏的信号放大技术对不能直接扩增的低浓度待测物质进行检测，在当前生化浅析探讨中尤为重要。在本论文的探讨中，以工具酶的信号放大技术为基础，结合化学发光检测和荧光定量PCR检测技术，分别提出了对单碱基突变和地沟油快速检测的策略。其主要内容如下：1.利用链置换循环放大化学发光法检测单碱基突变本章基于链置换循环放大和磁珠分离技术建立了一种操作简便、快速，室温下可以高灵敏度和高特异性的检测单碱基突变的化学发光生物传感器。本章中设计单碱基突变位点为T4DNA连接酶的连接位点，目标DNA若为突变体DNA，T4DNA连接酶则将发夹探针与报告探针连接起来，再通过Klenow Fragment（exo-）聚合酶进行信号的循环放大，最终检测化学发光信号；而当目标DNA为野生型DNA，T4DNA连接酶则不能将两条探针连接起来，也无法进行信号循环放大，由此检测不到化学发光信号。该策略利用T4DNA连接酶和KlenowFragment（exo~-）聚合酶进行化学发光信号的循环放大，最终实现了对DNA单碱基突变高灵敏度、高特异性的检测，其检测限为1.3×10~(–16)mol/L（3σ）。2.基于外源动物特点DNA荧光定量PCR快速检测地沟油的探讨本章中构建了一种基于线粒体特点序列和荧光定量PCR技术实现地沟油快速、灵敏检测的策略。本章转换检测的理念和检测对象，以样品油中外源动物特点DNA作为检测的靶标，设计可以辨别鱼和多种反刍动物线粒体的特点引物。以样品油中提取线粒体DNA后，利用荧光定量PCR策略，对提取的DNA进行信号扩增，通过样品Ct值的比较，可以定性甚至定量的对样品油作出判断。该策略将线粒体DNA的多拷贝数、小分子量、结构稳定和聚合酶链式反应的高灵敏度、高精准度相结合，以样品油中外源动物特点DNA作为检测的靶标，构建了地沟油快速、灵敏、特异的检测策略。关键词：信号放大论文化学发光论文单碱基突变论文线粒体DNA论文荧光定量PCR论文地沟油论文
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ABSTRACT5-11
第一章 前言11-35
1 常用信号放大技术12-20

1.1 无酶的信号放大策略12-17

1.1 基于纳米金的信号放大12-13

1.2 基于链式杂交反应的信号放大13-15

1.3 基于熵驱动的信号放大15-16

1.4 “发夹”DNA 催化自组装的信号放大16-17

1.2 工具酶信号放大策略17-20

1.2.1 聚合酶的信号放大17-18

1.2.2 内切酶与聚合酶联用的信号放大18-19

1.2.3 连接酶与聚合酶联用的信号放大19-20

2 单碱基突变20-25

2.1 单碱基突变介绍20-21

2.2 单碱基突变的检测21-25

2.1 荧光浅析法21-22

2.2 电化学策略22-23

2.3 寡核苷酸-纳米金探针法23-24

2.4 化学发光法24-25

3 地沟油介绍25-33

3.1 地沟油的概念25

3.2 地沟油的特点25-26

3.

2.1 物理特点25-26

3.

2.2 生物化学特点26

3.3 地沟油的危害26-27

3.

1. 导致腹泻、腹痛26

2 引发癌症26-27

3.3 影响婴幼儿发育27

3.4 地沟油的回收利用27-30

3.4.1 国外探讨进展27-29

3.4.

1.1 日本地沟油的回收利用27-28

3.4.

1.2 美国地沟油的回收利用28

3.4.

1.3 德国地沟油的回收利用28

3.4.

1.4 英国地沟油的回收利用28-29

3.4.

1.5 新西兰地沟油的回收利用29

3.4.2 国内探讨进展29-30
3.4.

2.1 生产涂料29

3.4.

2.2 生产洗涤剂29

3.4.

2.3 作为饲料添加油29

3.4.

2.4 生产生物柴油29-30

3.5 地沟油的检测30-33

3.5.1 检测指标30-31

3.5.

1.1 重金属30

3.5.

1.2 胆固醇30

3.5.

1.3 电导率30

3.5.

1.4 十二烷基苯磺酸钠30-31

3.5.1.5 脂肪酸不饱和度31论文导读：考文献65-73致谢73-75攻读硕士学位期间发表的论文目录75-76上一页12

3.5.2 检测策略31-33

3.5.

2.1 薄层色谱法31

3.5.

2.2 气相色谱法31

3.5.

2.3 电导率法31

3.5.

2.4 荧光法31-32

3.5.

2.5 紫外可见光度法32

3.5.

2.6 外源基因法32-33

4 本论文探讨的目的及作用33-35
第二章 利用链置换循环放大化学发光法检测单碱基突变35-49
1 引言35-36
2 实验部分36-40

2.1 仪器与试剂36-38

2.

1.1 实验试剂及配置36-37

2.

1.2 仪器37-38

2.2 DNA 链的设计38

2.3 DNA 链杂交结果的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征38

2.4 实验策略38-40

2.4.1 发夹探针的固定38-39

2.4.2 单碱基突变的检测39

2.4.3 化学发光检测39

2.4.4 检测策略的选择性39-40

3 结果与讨论40-48

3.1 检测原理40-41

3.2 DNA 链的设计结果41-42

3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳的表征结果42-43

3.4 实验条件的优化43-46

3.4.1 磁珠含量的影响43-44

3.4.2 HRP浓度的影响44-45

3.4.3 反应时间的优化45-46

3.5 化学发光生物传感器对单碱基突变的检测46-47

3.6 DNA 生物传感器选择性的探讨47-48

4 本章小结48-49
第三章 基于外源动物特点DNA荧光定量PCR快速检测地沟油的探讨49-64
1 引言49-50
2 实验部分50-53

2.1 仪器与试剂50-51

2.

1.1 试剂50

2.

1.2 仪器50-51

2.2 DNA 链的设计51

2.3 样品油中 DNA 的提取51-52

2.4 琼脂糖电泳检测 DNA52

2.5 荧光定量 PCR 检测 DNA52-53

3 结果与讨论53-63

3.1 实验原理53-54

3.2 DNA 链设计结果54-56

3.3 PCR 条件的优化56-59

3.1 循环数的优化56-58

3.2 退火温度的优化58-59

3.4 琼脂糖电泳检测不同油样的结果59-61

3.5 荧光定量 PCR 检测不同油样的结果61-63

4 本章小结63-64
结论64-65
参考文献65-73
致谢73-75
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