分析表型副溶血弧菌生物膜及LacZ基因融合实验技术平台建立学术

论文导读：置培养更适合褶皱表型,100rpm摇动培养方式更适合生物膜形成的定量测定；生物膜的形成在中性和偏碱环境中的差别不大；培养时间对刚果红染色的影响没有菌落表面褶皱那么显著,但都有培养时间越长表型越显著的走势；三种生物膜表型浅析试验都证明了OpaR负调控和ToxR正调控生物膜形成。用载体pHRP309成功构建出9个与VP生物膜或毒力相
摘要：背景：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)是一种革兰阴性嗜盐弧菌。广泛分布于海洋和其他咸水环境中,多数海产品均天然携带本菌,人们食入未煮熟或烹饪不当的产品,会引起胃肠炎或食物中毒,其流行具有季节性,一般温暖的月份(5月-10月)易爆发。该菌最早是以1950年日本大阪的海产品食物中毒事件体检中筛选出来,此事件中由该菌引发上的食物中毒占40-60%。近几年由VP引起急性胃肠炎占世界之首,在我国,特别是一些沿海城市,中毒事件在数量上超过沙门氏菌,是食源性病原菌之首。其主要症状体现为：腹泻、下腹绞痛、反胃、呕吐,治疗不及时会引起败血病及组织感染,严重者甚至死亡。由此,为降低食源性疾病的风险,有必要对副溶血弧菌的致病机制进行深入探讨。副溶血弧菌在存活和感染的历程中都能形成生物膜,同霍乱弧菌(Vibrio cholerae),哈氏弧菌(Vibrio harveyi)及创伤弧菌(Vibrio vulnificus)一样,生物膜在其适应环境和广泛传播历程中发挥着重要作用。生物膜的形成和消散是一个动态历程,这历程有着一系列基因表达的变化,而主要调控这些基因表达的就是密度感应(Quorum Sensing,QS)系统,VP的QS系统调控子蛋白OpaR与哈氏弧菌的LuxR在氨基酸序列上有96%的同源性,由此二者的QS系统应该具有相似的作用机制。虽然表型实验及表达谱浅析表明OpaR能调控VP荚膜多糖基因、胞外多糖基因、c-di-GMP分子代谢及鞭毛基因等生物膜形成相关基因的表达,但是OpaR对这些基因的转录调控机制并未被阐明,由此有必要做进一步的探讨。目的：本探讨目的期望建立副溶血弧菌RIMD2210633生物膜表型浅析实验案例和LacZ实验的技术平台。为进一步探讨转录调控子OpaR的转录调控机制,以及副溶血弧菌后其他调控子的功能奠定基础。策略：(1)生物膜表型实验案例：生物膜形成历程中可能会受很多因素的影响,包括温度、pH、盐度、营养情况、培养方式及培养基等,通过对这些因素的比较和浅析,建立了3种不同的生物膜表型浅析策略(菌落表面褶皱、生物膜基质的刚果红染色、生物膜的结晶紫染色)。并通过对VP突变株(ΔopaR、ΔtoxR)与野生株(J5421)的生物膜测定浅析,来验证这三个生物膜表型试验各自的技术平台的稳定性。(2)LacZ报告基因融合实验技术：PCR扩增靶基因的整个启动子区序列,并将其直接克隆入pHRP309质粒中,构建重组质粒。将VPA1513重组质粒转入VP野生株(WT)和OpaR突变株(AopaR)中,而后通过比较二者β-半乳糖苷酶活性的差别,确定OpaR对VPA1513的调控联系,以检验实验平台的稳定性。结果：30℃比37℃更适合VP生长而形成生物膜,在两种温度下,200rpm振荡培养12h就到平台期了；VP在营养丰富的HI平板比营养次之的LB、M、APW#3平板的菌落褶皱更显著；盐浓度越低(为0.5%)褶皱越显著；静置培养更适合褶皱表型,100rpm摇动培养方式更适合生物膜形成的定量测定；生物膜的形成在中性和偏碱环境中的差别不大；培养时间对刚果红染色的影响没有菌落表面褶皱那么显著,但都有培养时间越长表型越显著的走势；三种生物膜表型浅析试验都证明了OpaR负调控和ToxR正调控生物膜形成。用载体pHRP309成功构建出9个与VP生物膜或毒力相关基因的的LacZ(?)重组质粒；并通过测定VP突变株AopaR与野生株(J5421)β-半乳糖苷酶活性的差别,证明了OpaR对VPA1513的转录具有抑制作用。结论：成功建立了菌落表面褶皱、生物膜基质的刚果红染色、生物膜的结晶紫染色三种VP生物膜相关的表型试验和LacZ报告基因融合实验的稳定的技术平台。发现了温度、盐浓度、培养时间、培养方式和营养情况对生物膜形成有影响,且偏碱环境不会影响生物膜的形成。本探讨给后续生物膜表型和其他转录调控机制的探讨奠定了基础。关键词：VP论文生物膜表型论文lacZ论文OpaR论文调控论文
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缩略词表6-8
摘要论文导读：
8-10
Abstract10-12
文献综述12-27

1.副溶血弧菌生物学特性12-13

1.1 形态12

1.2 生长条件12-13

2.副溶血弧菌的流行性13

3.副溶血弧菌的毒力因子及致病机制13-17

3.1 溶血素13-14

3.2 酶类14-15

3.3 黏附因子15

3.4 Ⅲ型分泌系统15-17

4.副溶血弧菌生物膜探讨近况17-27

4.1 鞭毛18-19

4.2 菌毛19

4.3 多糖19-22

4.4 环二鸟苷酸(c-di-GMP)22-24

4.5 弧菌的密度感应(Quorum sensing QS)系统24-27

第一章 副溶血弧菌生物膜表型实验平台的建立27-42

1.引言27-28

2.材料28-29

2.1 菌株28

2.2 主要培养基28-29

3.策略29-32

3.1 菌种的准备29

3.2 生长曲线的测定29

3.3 菌落表面褶皱实验条件的优化29-31

3.1 营养环境的优化29-30

3.2 培养方式的优化30-31

3.3 培养时间的优化31

3.4 生物膜基质的刚果红染色条件的优化31

3.5 生物膜的结晶紫染色实验条件的摸索31-32

4.结果与浅析32-39

4.1 生长曲线32-33

4.2 菌落表面褶皱33-36

4.

2.1 营养环境的选择33-34

4.

2.2 褶皱培养方式的选择34-35

4.

2.3 褶皱中预培养静置时间的选择35-36

4.3 生物膜基质的刚果红染色结果36-37

4.4 生物膜的结晶紫染色实验37-39

5.讨论39-41

6.总结41-42

第二章 LacZ报告基因融合实验平台的建立42-49

1.材料和策略42-45

1.1 材料42-43

1.1 菌株与质粒42

1.2 主要试剂42-43

1.2 重组质粒的构建43-44

1.2.1 引物设计与PCR扩增43-44

1.2.2 质粒与PCR产物的酶切与连接44

1.2.3 连接产物的转化44

1.2.4 重组克隆的鉴定44

1.3 LacZ融合实验44-45

1.3.1 重组质粒的转化与筛选44

1.3.2 β-半乳糖营酶活性检测44-45

2.实验结果45-47

2.1 重组质粒的构建45-46

2.

1.1 靶基因启动子区的扩增45

2.

1.2 阳性克隆的鉴定45-46

2.2 OpaR蛋白对VPA1513的转录调控46-47

2.1 LacZ实验菌株的鉴定46-47

2.2 OpaR抑制VPA1513的转录47

3.讨论47-49

参考文献49-57
致谢57