重组人源前列腺特异性抗原（rPSA）-hFc融合蛋白在昆虫细胞中表达与探讨

论文片段—A可以替代PSA国际标准品,本实验为前列腺特异性抗原诊断试剂盒的标准品替代奠定了基础。关键词：前列腺特异性抗原(PSA)论文前列腺特异性抗原诊断试剂盒论文标准品论文Bac论文to论文Bac论文昆虫细胞真核表达论文酶联免疫吸附法(ELISA)论文前列腺特异性抗原(PSA)论文,前列腺特异性抗原诊断试剂盒论文,标准品论文,Bac论文,to论文,Bac论文,昆虫细胞真核表达论文,酶联免疫吸附法(ELISA)论文,
摘要：近年来,数以千计的不同种类蛋白已经成功利用昆虫细胞表达系统表达,其中包括多种蛋白酶,细胞表面蛋白。昆虫细胞表达出的蛋白具有较好的空间构型,糖基化修饰,并且表达量也相对较高,因此利用昆虫细胞表达系统表达出的蛋白,被广泛用在蛋白质功能、蛋白质作用的研究中,并在产品开发中被用于制备高效疫苗毕业论文致谢词。在以往前列腺特异性抗原(PSA)检测试剂盒中,标准品通常是由天然蛋白纯化而来,但标准品存在诸多缺点,如批次间稳定性差,不利于纯化单一形式蛋白,纯化成本较高等等,为了解决这些问题,本实验利用昆虫细胞表达系统Bac to Bac表达重组前列腺特异性抗原。为方便纯化提高重组前列腺特异性抗原的稳定性,使用人源IgG2的Fc片段融合PSA表达。实验中,在昆虫细胞中表达并纯化出的PSA-Fc融合蛋白,标准品的替代实验证明重组PSA可以替代PSA国际标准品,本实验为前列腺特异性抗原诊断试剂盒的标准品替代奠定了基础。关键词：前列腺特异性抗原(PSA)论文前列腺特异性抗原诊断试剂盒论文标准品论文Bac论文to论文Bac论文昆虫细胞真核表达论文酶联免疫吸附法(ELISA)论文
摘要2-3
Abstract3-6
前言6-7
篇 实验7-45
章 与方法7-20

1.1 7-11

1.1 Bac to Bac 细胞表达系统7

1.2 溶液7-10

1.3 培养液10

1.4 PSA 单克隆抗体10-11

1.5 其他11

1.2 方法11-20

1.2.1 CRL-1740 前列腺癌细胞系的培养11-12

1.2.2 CRL-1740 前列腺癌细胞系的RNA 抽提与反转录12

1.2.3 PSA 的基因克隆12-14

1.2.3.1 PSA 的巢式 PCR 克隆12-13

1.2.3.2 扩增产物的酶切验证13-14

1.2.3.3 扩增产物胶回收后T 载体转化14

1.2.4 pFastBac-Fc-GP64 质粒的构建14-15

1.2.4.1 GP64 信号肽的构建14

1.2.4.2 人源IgG2Fc 的克隆并引入HindIII 和XhoI 酶切位点14-15

1.2.5 重组PSA 杆状病毒的与蛋白表达的验证15-16

1.2.5.1 Donor 质粒转化DH10BacTM15

1.2.5.2 Bacmid-PSA 重组杆粒的抽提15

1.2.5.3 重组杆粒的验证15-16

1.2.6 PSA 重组杆状病毒的16

1.2.6.1 HighFive 昆虫细胞的培养16

1.2.6.2 PSA 重组杆状病毒的包装与16

1.2.7 PSA 蛋白的大量表达16-17

1.2.7.1 High Five 细胞的悬浮驯化培养16-17

1.2.7.2 High Five 细胞表达重组PSA-Fc17

1.2.8 PSA 蛋白纯化17

1.2.9 PSA 抗体的纯化和辣根过氧化物酶(HRP)的标记17-20

1.2.9.1 硫酸铵盐析法纯化抗体17

1.2.9.2 抗体与HRP 酶的交联（戊二醛两步法）17-18

1.2.9.3 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）18

1.2.9.4 夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）18-19

1.2.9.5 Western-Blot19-20

章 结果20-39

2.1 PSA 基因的克隆20-24

2.

1.1 CRL-1740 前列腺癌细胞株的RNA 抽提20-21

2.

1.2 PSA 基因的巢式 PCR21-24

2.2 pFASTBac-Fc-GP64 质粒的构建24-26

2.3 pFastBac-PSA-GP64-Fc 转移质粒的构建26-27

2.4 重组PSA 杆状病毒的制备与扩增27-28

2.5 重组PSA 杆状病毒的制备28-29

2.6 High Five 昆虫细胞的大规模培养与蛋白的制备29-33

2.7 Biocheck 游离PSA 检测试剂盒检测国际标准品和 rPSA在Biocheck 试剂盒中的性33-34
2.8 自制游离PSA 检测试剂盒检测国际标准品和rPSA 在自制游离PSA 检测试剂盒中的性34-36
2.9 自制总PSA 检测试剂盒衡量国际标准品，重组纯化PSA作为标准品的线性性36-39
章 讨论39-42
已申请专利42-43
参考文献43-45
文献综述45-58

一、蛋白纯化前必要的信息45-46

二、蛋白样品的提取46

三、蛋白的分离46-52

四、抗体的工程化纯化52-57

参考文献57-58
附录I--已申请专利58-59
附录II—PSA 基因克隆测序比对结果59-61
附录III—GP64 信号肽测序比对结果61-62
附录IV—HumanIgG2Fc 测序比对结果62-65
致谢65