浅议曲霉曲酸生产菌株选育及工艺优化

论文导读：
摘要：曲酸(Kojic acid)，一种用途广泛的弱酸化合物，化学名称为5-羟基-2-羟-1,4-吡喃酮，具有抑制酪氨酸酶能力、抑菌能力和对氧化酶的抑制作用以及与金属离子发生螯合反应等性质。作为一种新型的食品和化妆品添加剂，被普遍运用在食品、化妆品、医药等领域。国内外许多学者都对曲酸的探讨产生巨大的兴趣。但是目前国内外曲酸发酵生产技术尚不够成熟，市场上的曲酸供不应求，昂贵，由此必须大力开展曲酸发酵生产的探讨。文章以5种实验菌株中筛选得到一株米曲霉菌株。以它作为出发菌株，经过紫外诱变和氮离子注入诱变两种复合诱变，得到一株曲酸高产菌株；同时对该菌株的发酵生产工艺进行了探讨，对影响曲酸合成的相关因素进行了比较系统的考察，并且对曲酸的提取策略进行了初步探讨；最后进行了高产菌株的50L发酵罐实验。以5种可产曲酸的实验菌株中筛选出一株具有优良性状的曲酸生产菌CICC-2336，并且测定出其原始产酸量为12g/L。以米曲霉CICC-2336作为出发菌株，对其进行紫外诱变和氮离子注入诱变两种复合诱变，首先，进行紫外诱变，15W紫外灯30cm处照射40s条件下获得米曲霉突变株UV7，产酸量18.50g/L；再以米曲霉变异株UV7为出发菌株，注入能量10keV，注入剂量为10×1014ions/cm2·s的N+注入诱变，得到另一株突变菌株N11，产酸量为24.12g/L。与原始菌株CICC-2336产酸量相比，提升101%。通过对突变菌株N11进行单因素试验，确定最优碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母膏；再采取Plackett-Burman试验设计法考察发酵培养基中各组分对曲酸产量的影响，结果表明：葡萄糖、酵母膏、KH2PO4的浓度对曲酸的产量影响显著；再用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，并结合Box-Behnken实验设计和响应面浅析法对3个显著因素进行回归浅析，得出曲酸发酵的最佳培养基为葡萄糖添加量10.87%，酵母膏添加量为0.26%，KH2PO4添加量为0.06%，KCl0.05%，MgSO4·7H2O0.05%，曲酸产量为24.34g/L。通过对突变菌株N11脱色工艺进行单因素试验，确定活性炭脱色最佳条件为：6%的活性炭用量、80℃的脱色温度、45min的脱色时间，最终得到70.34%的脱色率，90.12%的曲酸收率。通过利用强酸型阳离子交换树脂交换去除粗制曲酸溶液中的杂质阳离子后，采取直接浓缩结晶的策略直接制得曲酸结晶，最终获得的曲酸结晶的收率为72.63%，产品纯度为95.54%。对突变菌株N11进行了50L发酵罐的实验，经过发酵条件的调试，确定在接种量15%，发酵温度30℃、转速为120r/min、通气量在10L/min的条件下，发酵7d后，曲酸的产量达到25.23g/L。关键词：米曲霉论文曲酸论文诱变论文响应面浅析论文提取论文发酵特性论文
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ABSTRACT7-9
致谢9-15
第一章 前言15-25

1.1 曲酸的结构及理化性质15-17

1.1 曲酸的分子结构15-16

1.2 曲酸的理化性质16

1.3 曲酸的生理活性16-17

1.2 曲酸的生产17-18

1.2.1 曲酸的生产菌种17

1.2.2 曲酸的合成途径17-18

1.3 曲酸的探讨近况18-22

1.3.1 国内外的探讨近况18-20

1.3.2 曲酸的运用20-22

1.4 诱变策略的概述22-23

1.5 本课题探讨的作用与主要内容23-25

1.5.1 本课题探讨的作用23

1.5.2 探讨内容23-25

第二章 出发菌株的筛选及高产菌株的诱变选育25-35

2.1 材料与策略25-28

2.

1.1 实验菌种25

2.

1.2 培养基25

2.

1.3 主要试剂与仪器设备25-26

2.

1.4 培养策略26

2.

1.5 曲酸标准曲线的绘制及菌种生长曲线的测定26

2.

1.6 出发菌株的筛选26

2.

1.7 菌种诱变26-28

2.

1.8 突变菌株传代实验28

2.

1.9 曲酸含量的测定策略28

2.2 结果与浅析28-34

2.1 曲酸标准曲线28-29

2.2.2 出发菌株的筛选结论文导读：7菌种的生长曲线32-332.2.8突变菌株的遗传稳定性33-342.3结论34-35第三章突变菌株N11发酵培养基的优化35-473.1材料与策略35-383.1.1实验菌株与培养基353.1.2主要试剂与仪器35-363.1.3培养策略363.1.4单因素实验36-373.1.5Plackett-Burman试验373.1.6最陡爬坡试验设计37-383.1.7CCD试验383.2结果与浅析38-4
果29

2.3 显色筛选板29

2.4 紫外诱变存活率及选育结果29-30

2.5 亚硝酸盐诱变的存活率及选育结果30-31

2.6 N+注入诱变存活率及选育结果31-32

2.7 菌种的生长曲线32-33

2.8 突变菌株的遗传稳定性33-34

2.3 结论34-35

第三章 突变菌株 N11 发酵培养基的优化35-47

3.1 材料与策略35-38

3.

1.1 实验菌株与培养基35

3.

1.2 主要试剂与仪器35-36

3.

1.3 培养策略36

3.

1.4 单因素实验36-37

3.

1.5 Plackett-Burman 试验37

3.

1.6 最陡爬坡试验设计37-38

3.

1.7 CCD 试验38

3.2 结果与浅析38-46
3.

2.1 单因素的确定38-39

3.

2.2 Plackett-Burman 设计筛选重要影响因素39-41

3.

2.3 最陡爬坡实验探讨最大响应值的响应区域41-42

3.

2.4 响应面优化42-46

3.3 结论46-47
第四章 N11 发酵产曲酸的提取工艺探讨47-52

4.1 材料与策略47-49

4.

1.1 主要试剂与仪器47-48

4.

1.2 曲酸的测定策略48

4.

1.3 曲酸粗产品的制备48

4.

1.4 脱色工艺48

4.

1.5 离子交换树脂去杂质48-49

4.2 结果与浅析49-50
4.

2.1 曲酸粗产品的制备结果49

4.

2.2 活性炭用量的确定49

4.

2.3 脱色温度的确定49-50

4.

2.4 脱色时间的确定50

4.

2.5 离子交换树脂去杂质的结果50

4.3 结论50-52
第五章 突变菌株的 50L 发酵罐实验52-57

5.1 实验材料与策略52-55

5.

1.1 实验菌种52

5.

1.2 实验主要试剂52

5.

1.3 主要仪器与设备52-53

5.

1.4 培养基53

5.

1.5 菌种活化53

5.

1.6 种子液的配制53

5.

1.7 发酵条件53

5.

1.8 检测策略53-55

5.2 实验结果与浅析55-56

5.3 结论56-57

第六章 结论与展望57-59

6.1 结论57-58

6.2 展望58-59

参考文献59-64
攻读硕士期间发表的文章64-66