阐释小鼠三表法抗Ⅳ诱导小鼠肺炎TRAF2/NF-KBP65/MYD88蛋白活化时效
最后更新时间：2024-03-10
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论文导读：存活只数、肺组织病变程度、肺指数和荧光探针PCR检测技术检测小鼠肺组织中不同时点IV－RNA的病毒载量差别，评价模型。2采取正交实验设计策略，以乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数为考察因素，以麻杏石甘汤9个供试品出膏率，和运用高效液相色谱浅析法浅析9个供试品中主要有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的
摘要：目的:建立甲型流感病毒FM1株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型；正交设计麻杏石甘汤醇提策略，运用高效液相色谱法定量浅析正交设计9水平麻杏石甘汤提取物中有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪含量；以“伤寒三表法”立论，观察三表法对甲型流感病毒FM1株感染鸡胚的防治作用及其对正常免疫、免疫低下小鼠流感病毒肺炎肺组织病毒载量的防治作用；探讨甲型流感病毒FM1株滴鼻感染正常免疫和免疫低下幼龄鼠诱导小鼠肺炎，小鼠肺组织中TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路时效性联系。材料与策略：1建立不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠滴鼻感染甲型流感病毒FM1株诱导小鼠肺炎模型，以小鼠一般状态、存活只数、肺组织病变程度、肺指数和荧光探针PCR检测技术检测小鼠肺组织中不同时点IV－RNA的病毒载量差别，评价模型。2采取正交实验设计策略，以乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数为考察因素，以麻杏石甘汤9个供试品出膏率，和运用高效液相色谱浅析法浅析9个供试品中主要有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的含量，并将浅析结果作为工艺评价指标，筛选最佳醇提策略。3配制1%健康豚鼠血红细胞，运用血凝实验策略观察不同浓度银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及三方不同组合的提取物，在不同时间点，体外直接抑制IV作用；探讨不同浓度银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及三方不同组合的提取物对IV感染鸡胚的预防和保护作用，筛选最佳配伍抗病物为体内实验做前期探讨。4采取荧光探针检测策略，将不同免疫的幼龄小鼠分为正常免疫宣表组（麻杏石甘汤组）、正常免疫双表组（玉屏风散+银翘散组）、正常免疫三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、免疫低下三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、正常免疫利巴韦林组、免疫低下利巴韦林组、正常免疫模型组、免疫低下模型组，观察各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织不同时点IV-RNA的病毒载量的差别，评价三表法对IV感染不同免疫状态的幼龄小鼠诱导小鼠肺炎的防治作用；5采取荧光探针检测策略，将不同免疫的幼龄小鼠分为正常免疫宣表组（麻杏石甘汤组）、正常免疫双表组（玉屏风散+银翘散组）、正常免疫三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、免疫低下三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、正常免疫利巴韦林组、免疫低下利巴韦林组、正常免疫模型组、免疫低下模型组，观察各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织不同时点IV-RNA的载量。6采取免疫印迹技术（western blot），探讨三表法抗甲型流感病毒FM1株（IV）诱导不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠肺炎肺组织的TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路的时效性联系。结果：1甲型流感病毒FM1株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型比较探讨：1.1IV鸡胚半数感染量的测定（EID50）:IV的EID50为10-6.5；1.2甲型流感病毒FM1株感染不同鼠龄正常免疫昆明种小鼠诱导小鼠肺炎的比较探讨：IV的EID550为10-4.；造模各组比较得出：幼龄、成龄及老龄正常组小鼠一般状态最好、全部存活；幼龄模型组一般状态最差，死亡最多，在第5天达到死亡高峰，与其他各组比较均有显著性差别（P＜0.05）；不同时点取小鼠肺组织，观察其外观病变程度，结果显示：各正常组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变；幼龄模型组肺组织病变最重，各时间点与正常组、成龄模型组、老龄模型组比较均有显著性差别（P＜0.05）。肺指数比较：幼龄模型组肺指数最高，与正常组、成龄模型组及老龄模型组比较均有显著差别（P﹤0.05），感染第5天肺指数达到最高。成龄模型组肺指数与正常组比较无显著性差别（P﹥0.05），与幼龄模型组比较有显著差别（P﹤0.05），其肺指数显著低于幼龄模型组肺指数。老龄模型组肺指数与正常组比较在第3、5天无显著性差别（P﹥0.05），与正常组比较在第7天有显著差别（P﹤0.05），与幼龄模型组比较有显著差别（P﹤0.05），其肺指数显著低于幼龄模型组肺指数。荧光定量PCR检测结果得出：幼龄鼠肺组织病毒载量最高，与其他各组比较有显著性差别（P﹥0.05）。1.3甲型流感病毒FM1株感染不同鼠龄免疫低下动物模型的比较探讨：IV的EID50为10-5.5；结果表明：幼龄、成龄正常组小鼠一般状态最好、全部存活，幼龄CP组状态较成龄CP组状态差，幼CP+IV组一般状态最差，死亡最多，在造模后7天内大批死亡，14天内共死亡13只，与正常组及成龄模型组比较均有显著性差别（P＜0.05）。成CP+IV组14天内共死亡5只，与正常组比较有显著性差别（P＞0.05）。不同时点取小鼠肺组织，观察其外观病变程度，结果显示：幼NS组、论文导读：
成NS组、幼CP组、成CP组，各组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变；幼CP+IV组肺组织病变最重，各时间点与其他各组比较均有显著性差别（P＜0.05），幼龄CP+IV组第5天与第3天比较，病变显著加重，有显著性差别（P＜0.05），第7天与第5天比较病变显著加重，有显著性差别（P＜0.05），说明第5-7天为幼龄CP+IV组肺组织病变最显著时期；成龄CP+IV组第3天出现较为显著的肺组织病变，第5天肺组织病变减轻，第7天与第5天比较无显著性差别（P＞0.05）。各组小鼠在不同时点肺指数比较：幼CP+IV组肺指数最高，与其他各组比较均有显著差别（P﹤0.05），感染第5天肺指数达到最高。成CP+IV组肺指数在第7天达到最高，与正常组比较有显著性差别（P﹤0.05），与：幼CP+IV组比较有显著差别（P﹤0.05），其肺指数显著低于：幼CP+IV组肺指数。荧光定量PCR检测结果得出：幼龄鼠肺组织病毒载量最高，与其他各组比较有显著性差别（P﹥0.05）。2正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨与银翘散、玉屏风散醇提取物的制备2.1正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨采取正交实验设计策略，以乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数为考察因素，以麻杏石甘汤中主要有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的定量检测及出膏率作为工艺评价指标，筛选最佳醇提策略。出膏率分别为：1号供试品，9.864%；2号供试品，16.891%；3号供试品，14.353%；4号供试品，13.878%；5号供试品，17.600%；6号供试品，13.947%；7号供试品，11.150%；8号供试品，16.389%；9号供试品，14.298%。由直观浅析及方差浅析结果可见：对出膏率影响最大的为提取次数，其次为提取时间和乙醇浓度，溶媒倍数影响较小。2.2银翘散精简方、玉屏风散醇提提取物的制备银翘散精简方：出膏率为16.46g，出膏率为14.44%；玉屏风散醇提出膏率为53.7810g，出膏率为25.16%3高效液相色谱法定量浅析有效活性成分正交设计9水平供试品有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的含量苦杏仁苷含量以高到低依次为：6号（2333）8倍90%乙醇150min热回流3次；3号（1333）6倍90%乙醇150min热回流3次；8号（3222）10倍70%乙醇120min2次；7号（3111）10倍50%乙醇90min热回流1次；5号（2222）8倍70%乙醇120min热回流2次；2号（1222）6倍70%乙醇120min热回流2次；9号（3333）10倍90%乙醇150min热回流2次；4号（2111）8倍50%乙醇90min热回流1次；1号（1111）6倍50%乙醇90min热回流1次。盐酸含量以高到低依次为：5号（2222）8倍70%乙醇120min热回流2次；2号（1222）6倍70%乙醇120min热回流2次；9号（3333）10倍90%乙醇150min热回流2次；3号（1333）6倍90%乙醇150min热回流3次；4号（2111）8倍乙醇90min热回流1次；7号（3111）10倍50%乙醇90min热回流1次；1号（1111）6倍50%乙醇90min热回流1次；最少为6号（2333）8倍90%乙醇150min热回流3次和8号（3222）10倍70%乙醇120min2次。盐酸伪含量以高到低依次为：5号（2222）8倍70%乙醇120min热回流2次；8号（3222）10倍70%乙醇120min2次；2号（1222）6倍70%乙醇120min热回流2次；9号（3333）10倍90%乙醇150min热回流2次；3号（1333）6倍90%乙醇150min热回流3次；4号（2111）8倍乙醇90min热回流1次；7号（3111）10倍50%乙醇90min热回流1次；1号（1111）6倍50%乙醇90min热回流1次；最少为6号（2333）8倍90%乙醇150min热回流3次。4三表法药效学体内外实验探讨4.1三表法对流感病毒感染鸡胚的保护作用实验探讨4.1.1IV鸡胚半数感染量的测定（EID50）:EID.550为10--6；4.1.2中药提取物最大不凝血浓度：银翘散提取物最大不血凝的浓度均为2-4，即1.2234mg提取物量/ml；玉屏风散提取物最大不血凝的浓度均为2-6，即0.5656mg提取物量/ml；麻杏石甘汤提取物最大不凝血的浓度为2-6，即0.3109mg提取物量/ml；银翘散提取物、玉屏风散提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5，即银翘散2.4469mg提取物量/ml+玉屏风散1.1312mg提取物量/ml等比混合；银翘散提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5，即银翘散2.4469mg提取物量论文导读：
/ml+麻杏石甘汤0.6218mg提取物量/ml等比混合；玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-6，即玉屏风散0.5656mg提取物量/ml+麻杏石甘汤0.3109mg提取物量/ml等比混合；银翘散提取物、玉屏风提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5，银翘散2.4469mg提取物量/ml+玉屏风散1.1312mg提取物量/ml+麻杏石甘汤0.6218mg提取物量/ml等比混合；4.2.3各组药供试液在不同时间1-36h内体外直接抑制病毒作用：银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及不同组合的提取物混合药物均可不同程度直接抑制甲型流感病毒FM1的活性，作用时间以1h可持续到36h，按3.3的结果各组最大不凝血浓度供试液在不同时间点均能不同程度抑制病毒的增殖；其中药物在6小时～20小时范围内抑制病毒效果显著，12小时后作用逐渐减弱；银翘散提物体外直接抑制病毒作用在6小时最强，其抑制病毒滴度可达12倍；玉屏风散提取物体外直接抑制IV作用在12小时最强，抑制作用可持续达到8倍；麻杏石甘汤提取物体外直接抑制IV作用在6小时最强，抑制作用可持续达到12倍；银翘散提取物与玉屏风散提取物混合药物体外直接抑制IV作用在6小时最强，其抑制病毒滴度可达12倍；银翘散提取物与麻杏石甘汤提取物混合药物体外直接抑制IV作用在6-12小时最强，抑制作用可持续达到12倍；玉屏风散提取物与麻杏石甘汤提取物混合药物体外直接抑制IV作用在12小时最强，抑制作用可持续达到8倍；三方提取物混合药物但总体来说，体外直接抑制IV作用在6小时最强，抑制作用可持续达到8倍；各组提取物在不同时间点与西药利巴韦林对照组相比较未见优势。4.2.4各组提取物供试液对鸡胚最大无毒浓度的测定（TD0）：各组受试液最大无毒浓度为：A组银翘散19.5mg提取物/ml；B组玉屏风散36.2m提取物/ml；C组麻杏石甘汤9.95mg提取物/ml；混合提取组，由于是混合药物的等比配制，所以其浓度按各自2倍比稀释浓度相加平均值计算，如下：D组银翘散+玉屏风散57.5mg混合提取物/ml；E组银翘散+麻杏石甘汤48.95mg混合提取物/ml；F组玉屏风散+麻杏石甘汤14.025mg混合提取物/ml；G组银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤22.4mg混合提取物/ml。4.2.5三表法对甲型IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用探讨银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物各浓度对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较无显著优势；银翘散+玉屏风散提取物、银翘散+麻杏石甘汤提取物、玉屏风散+麻杏石甘汤提取物各浓度对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较无显著优势；银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物22.42mg/ml时，对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较有显著优势。银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚的治疗作用：银翘散提取物各浓度对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较无显著；玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物、银翘散+麻杏石甘汤提取物各组对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较无显著优势，可能其抗病毒作用弱于利巴韦林对照组；银翘散+玉屏风散提取物57.5mg/ml浓度时、屏风散+麻杏石甘汤提取物高浓度时、银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物在22.42mg/ml、11.2mg/ml、5.63mg/ml浓度时，对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较有显著优势。5三表法对甲型流感病毒滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的IV-RNA荧光定量肺组织IV载量的作用：三表法对与正常免疫IV诱导小鼠肺炎治疗效果更好，正常免疫三表组在第5、7天与其余各组比较用药后流感病毒载量，有显著差别（P＜0.05）6三表法对甲型流感病毒FM1株感染小鼠TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路时效性联系的探讨：7天内各组小鼠肺组织TRAF2蛋白表达呈稳定状态；正常免疫三表组在各时间点，其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达最弱，并呈稳定走势；正常免疫宣表组、免疫低下三表组、正常免疫模型组，肺组织NF-ΚBP65蛋白表达较为稳定，纵比组间，横比不同时间点，均无显著差别（P﹥0.05）。三表方药适时作用于正常免疫小鼠，可使其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达减弱；正常免疫三表组是各组间、各时间点中，其肺组织MYD88蛋白表达最弱的，并且各组随着时间的进展，肺组织MYD88蛋白表达趋于平稳。整体看来三表方药适时作用于正常免疫小鼠，可使其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达减弱；无药物干预的免疫低下模型组其肺组织MYD88蛋白表达在第5天大幅下降，推测可能与其免疫低下相关。3结论：3.1通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV－RNA的荧光定量测定综合判定验证，幼龄鼠可以成功论文导读：
塑造小鼠IV感染小鼠肺炎模型，虽然成龄鼠、老龄鼠模型组肺组织荧光定量PCR检测有IV病毒活动的迹象，但其肺组织病理HE未观察到肺炎病理转变，故成龄鼠、老龄鼠不能成功造模，幼龄鼠对流感病毒更具易感性，易造成IV肺炎模型。一次性大剂量的给予环磷酰胺腹腔注射，可以造成小鼠脾脏指数的升高，胸腺指数的下降，可以造成小鼠的免疫低下状态；通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV－RNA的荧光定量测定验证，幼龄鼠可以成功塑造IV感染免疫低下小鼠肺炎模型，成龄鼠不能成功造模；免疫低下幼龄鼠对流感病毒更具易感性，易造成IV感染免疫低下小鼠肺炎模型。3.2采取不同浓度的乙醇为提取溶媒对麻杏石甘汤进行提取，对麻杏石甘汤复方中绝大多数药材中的活性成分均有较好的提取效果，提取溶媒量及提取次数是影响出膏量重要因素，其次为提取时间。由直观浅析及方差浅析结果可见，对出膏率影响最大的为提取次数，其次为提取时间和乙醇浓度，溶媒倍数影响较小。3.3溶媒的浓度是决定正交设计9水平麻杏石甘汤有效活性成分醇提取含量多少的的重要因素，其次为提取时间和提取次数3.4不同浓度银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚具有较好的预防和治疗保护作用，其预防和治疗作用随药物浓度降低而有所减弱，但其对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用与西药利巴韦林相当，未见显著优势。不同浓度银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤混合物联合用药比单方对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用略强，与西药利巴韦林相当，其银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用优于利巴韦林注射剂，体现显著优势，给药先后顺序对血凝效价结果无显著影响。3.5以不同时间点的各组小鼠肺组织流感病毒载量来看，模型组其肺组织病毒载量随时间呈递增走势；用药各组其肺组织病毒载量随时间成递减走势；适时用药，变换方药比单方治疗更能抑制肺组织流感病毒病毒载量。3.6在IV诱导幼龄鼠肺炎的发病历程中，TRAF2/NFΚBP65/MYD88信号通路激活。三表方药适时作用于正常免疫小鼠，可使其肺组织TRAF2/NFΚBP65/MYD88蛋白活化表达稳定。7天内各组小鼠肺组织TRAF2蛋白表达呈稳定趋向状态。无药物干预的免疫低下模型组其肺组织MYD88蛋白表达在第5天大幅下降，推测可能与其免疫低下相关。关键词：流感病毒论文三表法论文小鼠论文免疫低下论文TRAF2论文NF-ΚBP65论文MYD88论文
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Abstract18-31
前言31-33
文献综述33-58
综述
第一章 “伤寒三表法”论述溯源58-62
第一节 “伤寒三表法”释义58-60
1 邪浅者，逐之于藩篱，散在皮毛58-59
2 渐深者，逐之于户牖，散在筋骨59
3 深入者，逐之于堂室，散在脏腑59-60
第二节 “伤寒三表法”与小儿肺系病证的治疗60-62
1 三表法与小儿肺系病证治疗、小儿肺系保健调摄60
2 小儿肺系病证用药宜轻论60
3 “三表法”代表方剂与小儿肺系外感热病防治60-62
第二章 三表法方剂的古籍探讨与儿科临床运用62-85
第一节 银翘散古籍探讨与儿科临床运用62-69
1 银翘散方中药物的功效与主治63-65
2 银翘散古籍记载剂量总结65-66
3 古今医家论银翘散66-68
4 银翘散在儿科病证临床中的运用68-69
第二节 玉屏风散古籍探讨与儿科临床运用69-77
1 玉屏风散方中药物的功效与主治69-72
2 玉屏风散古籍记载剂量总结72-73
3 古今医家论玉屏风散73-75
4 玉屏风散在儿科病证临床中的运用75-77
第三节 麻杏石甘汤的古籍文献探讨与儿科临床运用77-85
1 麻杏石甘汤方中药物的功效与主治78-79
2 麻杏石甘汤古籍记载剂量总结79-81
3 古今医家论麻杏石甘汤81-82
4 麻杏石甘汤在儿科病证临床中的运用82-85
第二部分 甲型流感病毒 FM1 株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型比较探讨85-114
第一章 鸡胚增毒85-87
材料85
策略85-86
结果86
浅析讨论86-87
第二章 甲型流感病毒 FM1 株感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的比较探讨87-114
第一节 甲型流感病毒 FM1 株感染不同鼠龄正常免疫昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的比较探讨87-100
材料87-88
策略88-91
结果91-98
结论98
浅析讨论文导读：设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨与银翘散、玉屏风散醇提取物的制备114-121第一节正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨114-118材料114-115策略115结果115-116结论116浅析讨论116-118第二节银翘散精简方、玉屏风散醇提提取物的制备118-1211银翘散精简方醇提提取物的制备1182玉屏风散醇提提取物的制备118-1193浅析
论98-100
第二节 甲型流感病毒 FM1 株感染不同鼠龄免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的比较探讨100-114
材料100
策略100-102
结果102-113
结论113
浅析讨论113-114
第三部分 三表法方剂醇提工艺优化及有效活性成分定量浅析114-134
第一章 正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨与银翘散、玉屏风散醇提取物的制备114-121
第一节 正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨114-118
材料114-115
策略115
结果115-116
结论116
浅析讨论116-118
第二节 银翘散精简方、玉屏风散醇提提取物的制备118-121
1 银翘散精简方醇提提取物的制备118
2 玉屏风散醇提提取物的制备118-119
3 浅析讨论119-121
第二章 高效液相色谱法定量浅析正交设计麻杏石甘汤供试品有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的含量121-134
第一节 高效液相色谱法定量浅析正交设计麻杏石甘汤供试品中苦杏仁苷的含量121-126
仪器与试药121
策略121
结果121-125
结论125
浅析讨论125-126
第二节 高效液相色谱法定量浅析正交设计麻杏石甘汤供试品中盐酸、盐酸伪麻 黄碱的含量126-134
仪器与试药126
策略126
结果126-133
结论133
浅析讨论133-134
第四部分 三表法药效学体内外实验探讨134-173
第一章 三表法对流感病毒感染鸡胚的保护作用实验探讨134-154
材料134-135
策略135-140
结果140-152
结论152-153
浅析讨论153-154
第二章 三表法对甲型流感病毒滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的 IV-RNA 荧光定量肺组织 IV 载量的作用154-161
材料154-156
策略156
结果156-160
结论160
浅析讨论160-161
第三章 三表法对甲型流感病毒 FM1 株感染小鼠 TRAF
策略162-165
结果165-171
结论171-172
浅析讨论172-173
参考文献173-183
致谢183-184
个人简历184
摘要：目的:建立甲型流感病毒FM1株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型；正交设计麻杏石甘汤醇提策略，运用高效液相色谱法定量浅析正交设计9水平麻杏石甘汤提取物中有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪含量；以“伤寒三表法”立论，观察三表法对甲型流感病毒FM1株感染鸡胚的防治作用及其对正常免疫、免疫低下小鼠流感病毒肺炎肺组织病毒载量的防治作用；探讨甲型流感病毒FM1株滴鼻感染正常免疫和免疫低下幼龄鼠诱导小鼠肺炎，小鼠肺组织中TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路时效性联系。材料与策略：1建立不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠滴鼻感染甲型流感病毒FM1株诱导小鼠肺炎模型，以小鼠一般状态、存活只数、肺组织病变程度、肺指数和荧光探针PCR检测技术检测小鼠肺组织中不同时点IV－RNA的病毒载量差别，评价模型。2采取正交实验设计策略，以乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数为考察因素，以麻杏石甘汤9个供试品出膏率，和运用高效液相色谱浅析法浅析9个供试品中主要有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的含量，并将浅析结果作为工艺评价指标，筛选最佳醇提策略。3配制1%健康豚鼠血红细胞，运用血凝实验策略观察不同浓度银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及三方不同组合的提取物，在不同时间点，体外直接抑制IV作用；探讨不同浓度银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及三方不同组合的提取物对IV感染鸡胚的预防和保护作用，筛选最佳配伍抗病物为体内实验做前期探讨。4采取荧光探针检测策略，将不同免疫的幼龄小鼠分为正常免疫宣表组（麻杏石甘汤组）、正常免疫双表组（玉屏风散+银翘散组）、正常免疫三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、免疫低下三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、正常免疫利巴韦林组、免疫低下利巴韦林组、正常免疫模型组、免疫低下模型组，观察各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织不同时点IV-RNA的病毒载量的差别，评价三表法对IV感染不同免疫状态的幼龄小鼠诱导小鼠肺炎的防治作用；5采取荧光探针检测策略，将不同免疫的幼龄小鼠分为正常免疫宣表组（麻杏石甘汤组）、正常免疫双表组（玉屏风散+银翘散组）、正常免疫三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、免疫低下三表组（玉屏风散+银翘散+麻杏石甘汤组）、正常免疫利巴韦林组、免疫低下利巴韦林组、正常免疫模型组、免疫低下模型组，观察各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织不同时点IV-RNA的载量。6采取免疫印迹技术（western blot），探讨三表法抗甲型流感病毒FM1株（IV）诱导不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠肺炎肺组织的TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路的时效性联系。结果：1甲型流感病毒FM1株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型比较探讨：1.1IV鸡胚半数感染量的测定（EID50）:IV的EID50为10-6.5；1.2甲型流感病毒FM1株感染不同鼠龄正常免疫昆明种小鼠诱导小鼠肺炎的比较探讨：IV的EID550为10-4.；造模各组比较得出：幼龄、成龄及老龄正常组小鼠一般状态最好、全部存活；幼龄模型组一般状态最差，死亡最多，在第5天达到死亡高峰，与其他各组比较均有显著性差别（P＜0.05）；不同时点取小鼠肺组织，观察其外观病变程度，结果显示：各正常组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变；幼龄模型组肺组织病变最重，各时间点与正常组、成龄模型组、老龄模型组比较均有显著性差别（P＜0.05）。肺指数比较：幼龄模型组肺指数最高，与正常组、成龄模型组及老龄模型组比较均有显著差别（P﹤0.05），感染第5天肺指数达到最高。成龄模型组肺指数与正常组比较无显著性差别（P﹥0.05），与幼龄模型组比较有显著差别（P﹤0.05），其肺指数显著低于幼龄模型组肺指数。老龄模型组肺指数与正常组比较在第3、5天无显著性差别（P﹥0.05），与正常组比较在第7天有显著差别（P﹤0.05），与幼龄模型组比较有显著差别（P﹤0.05），其肺指数显著低于幼龄模型组肺指数。荧光定量PCR检测结果得出：幼龄鼠肺组织病毒载量最高，与其他各组比较有显著性差别（P﹥0.05）。1.3甲型流感病毒FM1株感染不同鼠龄免疫低下动物模型的比较探讨：IV的EID50为10-5.5；结果表明：幼龄、成龄正常组小鼠一般状态最好、全部存活，幼龄CP组状态较成龄CP组状态差，幼CP+IV组一般状态最差，死亡最多，在造模后7天内大批死亡，14天内共死亡13只，与正常组及成龄模型组比较均有显著性差别（P＜0.05）。成CP+IV组14天内共死亡5只，与正常组比较有显著性差别（P＞0.05）。不同时点取小鼠肺组织，观察其外观病变程度，结果显示：幼NS组、论文导读：
成NS组、幼CP组、成CP组，各组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变；幼CP+IV组肺组织病变最重，各时间点与其他各组比较均有显著性差别（P＜0.05），幼龄CP+IV组第5天与第3天比较，病变显著加重，有显著性差别（P＜0.05），第7天与第5天比较病变显著加重，有显著性差别（P＜0.05），说明第5-7天为幼龄CP+IV组肺组织病变最显著时期；成龄CP+IV组第3天出现较为显著的肺组织病变，第5天肺组织病变减轻，第7天与第5天比较无显著性差别（P＞0.05）。各组小鼠在不同时点肺指数比较：幼CP+IV组肺指数最高，与其他各组比较均有显著差别（P﹤0.05），感染第5天肺指数达到最高。成CP+IV组肺指数在第7天达到最高，与正常组比较有显著性差别（P﹤0.05），与：幼CP+IV组比较有显著差别（P﹤0.05），其肺指数显著低于：幼CP+IV组肺指数。荧光定量PCR检测结果得出：幼龄鼠肺组织病毒载量最高，与其他各组比较有显著性差别（P﹥0.05）。2正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨与银翘散、玉屏风散醇提取物的制备2.1正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨采取正交实验设计策略，以乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数为考察因素，以麻杏石甘汤中主要有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的定量检测及出膏率作为工艺评价指标，筛选最佳醇提策略。出膏率分别为：1号供试品，9.864%；2号供试品，16.891%；3号供试品，14.353%；4号供试品，13.878%；5号供试品，17.600%；6号供试品，13.947%；7号供试品，11.150%；8号供试品，16.389%；9号供试品，14.298%。由直观浅析及方差浅析结果可见：对出膏率影响最大的为提取次数，其次为提取时间和乙醇浓度，溶媒倍数影响较小。2.2银翘散精简方、玉屏风散醇提提取物的制备银翘散精简方：出膏率为16.46g，出膏率为14.44%；玉屏风散醇提出膏率为53.7810g，出膏率为25.16%3高效液相色谱法定量浅析有效活性成分正交设计9水平供试品有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的含量苦杏仁苷含量以高到低依次为：6号（2333）8倍90%乙醇150min热回流3次；3号（1333）6倍90%乙醇150min热回流3次；8号（3222）10倍70%乙醇120min2次；7号（3111）10倍50%乙醇90min热回流1次；5号（2222）8倍70%乙醇120min热回流2次；2号（1222）6倍70%乙醇120min热回流2次；9号（3333）10倍90%乙醇150min热回流2次；4号（2111）8倍50%乙醇90min热回流1次；1号（1111）6倍50%乙醇90min热回流1次。盐酸含量以高到低依次为：5号（2222）8倍70%乙醇120min热回流2次；2号（1222）6倍70%乙醇120min热回流2次；9号（3333）10倍90%乙醇150min热回流2次；3号（1333）6倍90%乙醇150min热回流3次；4号（2111）8倍乙醇90min热回流1次；7号（3111）10倍50%乙醇90min热回流1次；1号（1111）6倍50%乙醇90min热回流1次；最少为6号（2333）8倍90%乙醇150min热回流3次和8号（3222）10倍70%乙醇120min2次。盐酸伪含量以高到低依次为：5号（2222）8倍70%乙醇120min热回流2次；8号（3222）10倍70%乙醇120min2次；2号（1222）6倍70%乙醇120min热回流2次；9号（3333）10倍90%乙醇150min热回流2次；3号（1333）6倍90%乙醇150min热回流3次；4号（2111）8倍乙醇90min热回流1次；7号（3111）10倍50%乙醇90min热回流1次；1号（1111）6倍50%乙醇90min热回流1次；最少为6号（2333）8倍90%乙醇150min热回流3次。4三表法药效学体内外实验探讨4.1三表法对流感病毒感染鸡胚的保护作用实验探讨4.1.1IV鸡胚半数感染量的测定（EID50）:EID.550为10--6；4.1.2中药提取物最大不凝血浓度：银翘散提取物最大不血凝的浓度均为2-4，即1.2234mg提取物量/ml；玉屏风散提取物最大不血凝的浓度均为2-6，即0.5656mg提取物量/ml；麻杏石甘汤提取物最大不凝血的浓度为2-6，即0.3109mg提取物量/ml；银翘散提取物、玉屏风散提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5，即银翘散2.4469mg提取物量/ml+玉屏风散1.1312mg提取物量/ml等比混合；银翘散提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5，即银翘散2.4469mg提取物量论文导读：
/ml+麻杏石甘汤0.6218mg提取物量/ml等比混合；玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-6，即玉屏风散0.5656mg提取物量/ml+麻杏石甘汤0.3109mg提取物量/ml等比混合；银翘散提取物、玉屏风提取物、麻杏石甘汤提取物混合药物最大不凝血的浓度为2-5，银翘散2.4469mg提取物量/ml+玉屏风散1.1312mg提取物量/ml+麻杏石甘汤0.6218mg提取物量/ml等比混合；4.2.3各组药供试液在不同时间1-36h内体外直接抑制病毒作用：银翘散提取物、玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物及不同组合的提取物混合药物均可不同程度直接抑制甲型流感病毒FM1的活性，作用时间以1h可持续到36h，按3.3的结果各组最大不凝血浓度供试液在不同时间点均能不同程度抑制病毒的增殖；其中药物在6小时～20小时范围内抑制病毒效果显著，12小时后作用逐渐减弱；银翘散提物体外直接抑制病毒作用在6小时最强，其抑制病毒滴度可达12倍；玉屏风散提取物体外直接抑制IV作用在12小时最强，抑制作用可持续达到8倍；麻杏石甘汤提取物体外直接抑制IV作用在6小时最强，抑制作用可持续达到12倍；银翘散提取物与玉屏风散提取物混合药物体外直接抑制IV作用在6小时最强，其抑制病毒滴度可达12倍；银翘散提取物与麻杏石甘汤提取物混合药物体外直接抑制IV作用在6-12小时最强，抑制作用可持续达到12倍；玉屏风散提取物与麻杏石甘汤提取物混合药物体外直接抑制IV作用在12小时最强，抑制作用可持续达到8倍；三方提取物混合药物但总体来说，体外直接抑制IV作用在6小时最强，抑制作用可持续达到8倍；各组提取物在不同时间点与西药利巴韦林对照组相比较未见优势。4.2.4各组提取物供试液对鸡胚最大无毒浓度的测定（TD0）：各组受试液最大无毒浓度为：A组银翘散19.5mg提取物/ml；B组玉屏风散36.2m提取物/ml；C组麻杏石甘汤9.95mg提取物/ml；混合提取组，由于是混合药物的等比配制，所以其浓度按各自2倍比稀释浓度相加平均值计算，如下：D组银翘散+玉屏风散57.5mg混合提取物/ml；E组银翘散+麻杏石甘汤48.95mg混合提取物/ml；F组玉屏风散+麻杏石甘汤14.025mg混合提取物/ml；G组银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤22.4mg混合提取物/ml。4.2.5三表法对甲型IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用探讨银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物各浓度对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较无显著优势；银翘散+玉屏风散提取物、银翘散+麻杏石甘汤提取物、玉屏风散+麻杏石甘汤提取物各浓度对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较无显著优势；银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物22.42mg/ml时，对IV感染鸡胚的预防作用与利巴韦林比较有显著优势。银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚的治疗作用：银翘散提取物各浓度对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较无显著；玉屏风散提取物、麻杏石甘汤提取物、银翘散+麻杏石甘汤提取物各组对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较无显著优势，可能其抗病毒作用弱于利巴韦林对照组；银翘散+玉屏风散提取物57.5mg/ml浓度时、屏风散+麻杏石甘汤提取物高浓度时、银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物在22.42mg/ml、11.2mg/ml、5.63mg/ml浓度时，对IV感染鸡胚的治疗作用与利巴韦林比较有显著优势。5三表法对甲型流感病毒滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的IV-RNA荧光定量肺组织IV载量的作用：三表法对与正常免疫IV诱导小鼠肺炎治疗效果更好，正常免疫三表组在第5、7天与其余各组比较用药后流感病毒载量，有显著差别（P＜0.05）6三表法对甲型流感病毒FM1株感染小鼠TRAF2、MYD88、NF-ΚBP65蛋白活化信号通路时效性联系的探讨：7天内各组小鼠肺组织TRAF2蛋白表达呈稳定状态；正常免疫三表组在各时间点，其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达最弱，并呈稳定走势；正常免疫宣表组、免疫低下三表组、正常免疫模型组，肺组织NF-ΚBP65蛋白表达较为稳定，纵比组间，横比不同时间点，均无显著差别（P﹥0.05）。三表方药适时作用于正常免疫小鼠，可使其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达减弱；正常免疫三表组是各组间、各时间点中，其肺组织MYD88蛋白表达最弱的，并且各组随着时间的进展，肺组织MYD88蛋白表达趋于平稳。整体看来三表方药适时作用于正常免疫小鼠，可使其肺组织NF-ΚBP65蛋白表达减弱；无药物干预的免疫低下模型组其肺组织MYD88蛋白表达在第5天大幅下降，推测可能与其免疫低下相关。3结论：3.1通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV－RNA的荧光定量测定综合判定验证，幼龄鼠可以成功论文导读：
塑造小鼠IV感染小鼠肺炎模型，虽然成龄鼠、老龄鼠模型组肺组织荧光定量PCR检测有IV病毒活动的迹象，但其肺组织病理HE未观察到肺炎病理转变，故成龄鼠、老龄鼠不能成功造模，幼龄鼠对流感病毒更具易感性，易造成IV肺炎模型。一次性大剂量的给予环磷酰胺腹腔注射，可以造成小鼠脾脏指数的升高，胸腺指数的下降，可以造成小鼠的免疫低下状态；通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV－RNA的荧光定量测定验证，幼龄鼠可以成功塑造IV感染免疫低下小鼠肺炎模型，成龄鼠不能成功造模；免疫低下幼龄鼠对流感病毒更具易感性，易造成IV感染免疫低下小鼠肺炎模型。3.2采取不同浓度的乙醇为提取溶媒对麻杏石甘汤进行提取，对麻杏石甘汤复方中绝大多数药材中的活性成分均有较好的提取效果，提取溶媒量及提取次数是影响出膏量重要因素，其次为提取时间。由直观浅析及方差浅析结果可见，对出膏率影响最大的为提取次数，其次为提取时间和乙醇浓度，溶媒倍数影响较小。3.3溶媒的浓度是决定正交设计9水平麻杏石甘汤有效活性成分醇提取含量多少的的重要因素，其次为提取时间和提取次数3.4不同浓度银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚具有较好的预防和治疗保护作用，其预防和治疗作用随药物浓度降低而有所减弱，但其对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用与西药利巴韦林相当，未见显著优势。不同浓度银翘散、玉屏风散、麻杏石甘汤混合物联合用药比单方对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用略强，与西药利巴韦林相当，其银翘散+玉屏风散+麻杏石甘汤提取物对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用优于利巴韦林注射剂，体现显著优势，给药先后顺序对血凝效价结果无显著影响。3.5以不同时间点的各组小鼠肺组织流感病毒载量来看，模型组其肺组织病毒载量随时间呈递增走势；用药各组其肺组织病毒载量随时间成递减走势；适时用药，变换方药比单方治疗更能抑制肺组织流感病毒病毒载量。3.6在IV诱导幼龄鼠肺炎的发病历程中，TRAF2/NFΚBP65/MYD88信号通路激活。三表方药适时作用于正常免疫小鼠，可使其肺组织TRAF2/NFΚBP65/MYD88蛋白活化表达稳定。7天内各组小鼠肺组织TRAF2蛋白表达呈稳定趋向状态。无药物干预的免疫低下模型组其肺组织MYD88蛋白表达在第5天大幅下降，推测可能与其免疫低下相关。关键词：流感病毒论文三表法论文小鼠论文免疫低下论文TRAF2论文NF-ΚBP65论文MYD88论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要11-18
Abstract18-31
前言31-33
文献综述33-58
综述
一、流感病毒探讨进展33-41
综述二、泛素化途径与人体免疫调节探讨进展41-54
综述三、中药抗流感病毒探讨进展54-58
第一部分 “伤寒三表法”论述探讨58-85第一章 “伤寒三表法”论述溯源58-62
第一节 “伤寒三表法”释义58-60
1 邪浅者，逐之于藩篱，散在皮毛58-59
2 渐深者，逐之于户牖，散在筋骨59
3 深入者，逐之于堂室，散在脏腑59-60
第二节 “伤寒三表法”与小儿肺系病证的治疗60-62
1 三表法与小儿肺系病证治疗、小儿肺系保健调摄60
2 小儿肺系病证用药宜轻论60
3 “三表法”代表方剂与小儿肺系外感热病防治60-62
第二章 三表法方剂的古籍探讨与儿科临床运用62-85
第一节 银翘散古籍探讨与儿科临床运用62-69
1 银翘散方中药物的功效与主治63-65
2 银翘散古籍记载剂量总结65-66
3 古今医家论银翘散66-68
4 银翘散在儿科病证临床中的运用68-69
第二节 玉屏风散古籍探讨与儿科临床运用69-77
1 玉屏风散方中药物的功效与主治69-72
2 玉屏风散古籍记载剂量总结72-73
3 古今医家论玉屏风散73-75
4 玉屏风散在儿科病证临床中的运用75-77
第三节 麻杏石甘汤的古籍文献探讨与儿科临床运用77-85
1 麻杏石甘汤方中药物的功效与主治78-79
2 麻杏石甘汤古籍记载剂量总结79-81
3 古今医家论麻杏石甘汤81-82
4 麻杏石甘汤在儿科病证临床中的运用82-85
第二部分 甲型流感病毒 FM1 株滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型比较探讨85-114
第一章 鸡胚增毒85-87
材料85
策略85-86
结果86
浅析讨论86-87
第二章 甲型流感病毒 FM1 株感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的比较探讨87-114
第一节 甲型流感病毒 FM1 株感染不同鼠龄正常免疫昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的比较探讨87-100
材料87-88
策略88-91
结果91-98
结论98
浅析讨论文导读：设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨与银翘散、玉屏风散醇提取物的制备114-121第一节正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨114-118材料114-115策略115结果115-116结论116浅析讨论116-118第二节银翘散精简方、玉屏风散醇提提取物的制备118-1211银翘散精简方醇提提取物的制备1182玉屏风散醇提提取物的制备118-1193浅析
论98-100
第二节 甲型流感病毒 FM1 株感染不同鼠龄免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的比较探讨100-114
材料100
策略100-102
结果102-113
结论113
浅析讨论113-114
第三部分 三表法方剂醇提工艺优化及有效活性成分定量浅析114-134
第一章 正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨与银翘散、玉屏风散醇提取物的制备114-121
第一节 正交设计优选麻杏石甘汤醇提提取策略探讨114-118
材料114-115
策略115
结果115-116
结论116
浅析讨论116-118
第二节 银翘散精简方、玉屏风散醇提提取物的制备118-121
1 银翘散精简方醇提提取物的制备118
2 玉屏风散醇提提取物的制备118-119
3 浅析讨论119-121
第二章 高效液相色谱法定量浅析正交设计麻杏石甘汤供试品有效活性成分苦杏仁苷、盐酸、盐酸伪的含量121-134
第一节 高效液相色谱法定量浅析正交设计麻杏石甘汤供试品中苦杏仁苷的含量121-126
仪器与试药121
策略121
结果121-125
结论125
浅析讨论125-126
第二节 高效液相色谱法定量浅析正交设计麻杏石甘汤供试品中盐酸、盐酸伪麻 黄碱的含量126-134
仪器与试药126
策略126
结果126-133
结论133
浅析讨论133-134
第四部分 三表法药效学体内外实验探讨134-173
第一章 三表法对流感病毒感染鸡胚的保护作用实验探讨134-154
材料134-135
策略135-140
结果140-152
结论152-153
浅析讨论153-154
第二章 三表法对甲型流感病毒滴鼻感染不同鼠龄正常免疫和免疫低下昆明种小鼠诱导小鼠肺炎模型的 IV-RNA 荧光定量肺组织 IV 载量的作用154-161
材料154-156
策略156
结果156-160
结论160
浅析讨论160-161
第三章 三表法对甲型流感病毒 FM1 株感染小鼠 TRAF
2、MYD88、NF-ΚBP65 蛋白活化信号通路时效性联系的探讨161-173
材料161-162策略162-165
结果165-171
结论171-172
浅析讨论172-173
参考文献173-183
致谢183-184
个人简历184