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浅议基因组全基因组测序技术进展和运用

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论文导读:通过化学降解法测定DNA序列。同年Sanger和Nicklen报道了双脱氧链终止序列测定法。上世纪80年代后期以来陆续出现了其他的一些测序方法:Hyma的焦磷酸测序法、Pfeifer的连接酶测序法等。DNA测序经历了三代的技术发展。以Sanger的双脱氧链终止法和Maxam化学降解法为基础发展而来的各种DNA测序技术被称为第一代测序技术。特
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全基因组测序技术的出现对医学所有领域来说都是一次革命性的进步。对于每个生物个体来说,基因组包涵了其整个的遗传信息。全基因组测序技术能够全面、精确地分析基因组的碱基序列,从而其所包含的信息,揭示基因组的复杂性、多样性。通过对不同个体或群体的比对,可以发现其中的遗传特性或突变,进而加深对各种疾病发生、发展的了解,进而制定相应的应对方法。全基因组测序技术将会使人类对自然界生物及自身的了解更加深入并给人类的健康带来实际利益。
1 全基因组测序技术的历史和发展
在DNA测序技术出现之前,蛋白质与RNA的测序就已见报道。Sanger于1949年测定了胰岛素的两条肽链氨基末端序列。Edman同年报道了蛋白质的氨基端测序技术。Sanger[3]1965年完成了大肠杆菌120个核苷酸的测定。对DNA测序最早出现在1954年,Whitfeld等提出了降解法[4],由于操作复杂,该方法并没有被广泛应用。成熟的DNA测序技术出现于上世纪70年代中期, Maxam和Gibert[5]报道了通过化学降解法测定DNA序列。同年Sanger和Nicklen[6]报道了双脱氧链终止序列测定法。上世纪80年代后期以来陆续出现了其他的一些测序方法:Hyma的焦磷酸测序法 [7]、Pfeifer的连接酶测序法[8]等。
DNA测序经历了三代的技术发展。以Sanger的双脱氧链终止法和Maxam化学降解法为基础发展而来的各种DNA测序技术被称为第一代测序技术。特点是易掌握、精确度高,缺点是操作过程复杂,耗时长,费用高昂。进入21世纪后,随着现代生物技术及计算机技术的发展,在第一代测序技术的基础上不断改进,逐渐形成了以高通量测序为特点的第二代技术,一次能对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测序,使得对一个物种的基因组或转录组测序变得方便易行。第二代测序技术保持了高准确度,大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。以单分子测序技术为基础的新一代测序方式被称为第三代测序技术。其技术缺陷是标记核苷酸的成本高,且测序错误率高。Adam Phillippy团队2012年将第二代和第三代测序技术结合到一起开发了近乎完全准确的长读取技术。2012年,Peters等[9]利用长片段读取技术(LFR)中“条形码”DNA拼接完整的基因组序列,在完整的人类基因组中仅有600个错误碱基。此技术极大地提高了全基因组测序的精度,显著降低在测试中所需的DNA量。
2 人类全基因组测序技术的应用

2.1疾病的诊断

2.1.1罕见病例的病因学诊断:Samra [10]通过对1例肢体末端黑素瘤病例的瘤变组织提取DNA后进行全基因组测序后分析其突变序列及其频率、范围,及选择性的DNA修复,并与普通的黑素瘤病例序列进行比对得出结论:此类疾病是黑素瘤的一种亚型并具有遗传特性,与COLO829细胞低相关性,其内在的不均一性使靶向治疗成为潜在的治疗方式。Eqan [11]对1例多发性骨髓瘤病例的4份肿瘤样本及其复发为浆细胞白血病后的血液样本进行了全基因组测序并进行了纵向的对比,发现高危的骨髓瘤患者瘤细胞基因序列的不均一性,其潜在的基因变异促进了骨髓瘤向浆细胞白血病的转化。Herdewyn [12]对侧索硬化症家系5个成员的血液样本进行全基因组测序发现侧索硬化症的致病原因是非致病基因C9orf72变异后的复制表达所导致。对罕见病例的诊断,以往临床医师仅仅停留在对症状的判断上。全基因组测序技术可以将其定位到基因序列的突变位点,进而制作相应的诊断工具,为临床治疗提供了新的思路和方法。
2.1.2流行病和常见病的预测、治疗:在流行病学领域,全基因组测序可以对病原体进行测序分析判断其来源及可能发生变异的频率及方向。Croville[13]在对家禽和迁徙水鸟的禽流感病毒进行全基因组测序分析发现,病毒基因潜在的多样性引起突变导致了疾病的变异,家禽自身的基因突变风险要小于迁徙水鸟带来突变基因的风险。Mary[14]对不同时期的脑膜炎双球菌的全基因组测序揭示了美国周期性爆发的血清Y型脑膜炎与变异抗原因子蛋白的基因变异有密切关联。Tram[15]针对越南肺结核杆菌的全基因组测序预示结核杆菌的耐药性变异将可能造论文导读:
成多重耐药结核杆菌在越南流行,需要采取相应的治疗预防措施。Gardy [16]对32株爆发期和4株爆发前期的结核分枝杆菌进行全基因组序列测序对比,得出这两组结核杆菌同源,结核爆发与基因变异无关。这些结论为临床分析及处理提供了一定的帮助。
通过对个人全基因组测序预测常见病,如:心血管病、糖尿病的发病风险似乎是可行的。但SusanMayor[17]并不同意这种说法,每个人有数百万基因序列,这些序列的变异可能导致的疾病目前还是未知的。现有条件下,利用全基因组测序并不能明确预测单个个体的发病风险。Cirulli[18]认为随着技术的发展,通过对普通疾病的致病原进行全基因组测序研究,能发现其中的罕见变异,并预测其发病风险,做出相应应对,降低其对危害人类健康的风险。
2.2癌症研究中的应用:第二代全基因组测序技术较早被应用到癌症的研究中[19]。Brose [20]首先将其应用于肺癌,发现BRAF (42)和EGFR (37)位点的突变。Campbell[21]2008年首次将大规模平行测序技术应用于肺癌研究,通过对两组肺癌细胞进行平行测序发现数百个与肺癌相关的基因突变及4种蛋白表达相关的突变序列。2010年,Lee[22]报道了对一个肺癌腺癌患者癌变组织平行测序获得的变异基因谱。2012年,Ju[23]通过对1例无吸烟史的肺腺癌患者癌组织和正常组织的平行测序发现肺腺癌相关新的融合基因KIF5B-RET。Sung[24] 针对肝癌展开了大规模的全基因组测序研究,对81例HBV阳性和7例HBV阴性的肝细胞癌和邻近正常组织进行了大规模平行测序,结果发现HBV整合在肝癌中是一种普遍现象。相比于正常组织,在肿瘤中,TERT、 MLL4 和 CCNE1基因的表达上调,表明这些基因可能在癌症的发生过程中起着重要作用。Fujimoto[25] 测序和分析了27个肝细胞癌的全基因组,其中25个与乙型或丙型肝炎病毒感染相关,多个染色质调控因子包括ARID1A, ARID1B, ARID2, MLL和MLL3在约50%的肿瘤中发生了突变,确定了病因学背景对于体细胞突变和随后癌变以及对HCCs中染色质调控因子复发性突变的影响。2.3遗传学中的应用:Roach[26]对1个家庭中2个子女及其父母进行了全基因组测序,清楚有效地找到编码孟德尔遗传特征的基因,并精确定位了遗传信息的染色体重组位点。随着对功能基因的认识加深,将能通过家族测序迅速找到相应的致病基因位点。血缘鉴定在基因研究中日渐重要,2个个体是否来源于同一个祖先,个体间的基因表达之间的关联,对绘制基因疾病图也有重要作用。Su[27]通过对54个不相关的个体的全基因组数据进行统计分析,可以得出其间是否具有同源性,这将对人类的基因研究提供基础。
全基因组测序在胎儿的遗传疾病诊断和治疗中也得到应用。小于3个月胎儿疾病的检测以往只能通过有创的检测,可能增加流产的几率。在孕期母体的血液包含有胎儿小于十分之一的DN段 [28]。Chu[29]通过对一对母子的血液DNA样本的测序分析指出:在满足DNA序列标签计数比例可以在指定染色体中准确测定,孕有非正常胎儿孕妇的比例高于孕有正常胎儿的孕妇这两个条件的基础上,无创检测胎儿的DNA样本是可行的。Kitzman[30]通过对两组3个月孕期母亲血液、脱细胞DNA及父亲的血液样本进行全基因组测序,试图找出其中属于胎儿的遗传信息,并进行重建胎儿DNA,从中获取胎儿遗传疾病相关的信息。全基因组测序技术的发展将为系统遗传学及产前胎儿遗传疾病诊断带来极大的发展。将为系统遗传学研究范围大大的拓展,更深入一些的研究以往无法继续研究的内容,如不显型的遗传突变等。
2.4个性化治疗中的应用:随着基因组测序的费用不断下降,将之用于临床病例,并为个人提供个性化的医疗服务可能成为现实。2012年1月,美国Life Technologies公司推出一款基因测序仪Ion Proton,仅需1天1000美元就可以对个人的基因组进行完全测序。基因测序技术应用于个体疾病的诊断中,Boris Pasche[31] 对此充满信心,在肿瘤学领域,基因组测序技术已经首先应用于个性化的诊断中,测序的结果可以立即了解基因突变的位置和内容。明确诊断本身对治疗就是论文导读:速提升。基因测序技术初期应用于噬菌体、细菌、病毒到逐渐应用于动物、植物后应用于人体,都取得了丰硕的成果,加深了对各种生物各项领域的理解,并逐步改造,创造了巨大的科研和社会效益。对人类自身的基因组测序加速了对人类遗传特性、遗传疾病、罕见及常见疾病的发生、发展的理解,并为提高人类的健康事业开辟了一条新的道路。
一个极大的促进。对基因的激活或抑制技术的发展会对患者的治疗起到巨大的影响,改变癌细胞分子特性的基因技术将会给癌症患者提供一个新的个性化治疗选择。
2.5测序技术在瘢痕研究中的应用:病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,是伴随创伤愈合而产生。其发病机制模糊,有遗传背景、种族倾向、易感个体[32]。病理性瘢痕的产生与成纤维细胞的过度增殖相关。这些增殖与一些蛋白的异常表达有关,P53蛋白、转化生长因子β及其亚型、胸腺素β4、livin、ac蛋白[33-35]等。这些蛋白的表达受上游基因调控,近来通过基因芯片技术已经筛选出大量与瘢痕相关的基因,HLA class I、HLA class II、HLA-DQA1、HLA-DQB1、COL1A1、COL11A1、Fas基因[36]等。对其中部分基因位点进行了测序研究,发现部分基因序列发生插入或缺失变异。基因芯片技术大大提高了瘢痕研究的深度和广度,但也有其明显的缺陷。如:不能对人体基因组进行全面的分析,仅能对已知基因进行表达检测;不能消除个体之间的差异因素;芯片杂交反应的敏感性、特异性不高、信号检测的灵敏度有待提高等[37]。全基因组测序技术的推广和应用或许会为病理性瘢痕研究带来新的思路和方法。通过对族系或散在的病理性瘢痕病例进行取样并测序,通过与正常人类基因组序列库比对分析,可以发现新的突变基因位点及致病因素,为瘢痕的防治提供新的方法和希望。
3 全基因组测序技术临床应用的限制[38]
随着费用的下降,全基因组测序在医学临床中的应用会快速增长。全基因组测序技术能获得更多的基因疾病相关的信息。根本性的提高了疾病信息及其特征的检测率,这些为临床带来了很大的机遇和挑战。测序前的知情同意要求让患者获得充分的信息,包括测序的好处、风险及局限性。加强了对疾病风险及疾病提前处理的信息及能力,并能获得更有针对性的治疗。患者应该被告知大部分的测序信息是没有意义和不重要的,只有少量的数据与特定的疾病相关。患者应该被告知他们可能潜在的有更多的其他疾病的风险,有可能因此受惊吓。频繁的不显的突变会让每位患者都可能是某一个严重疾病的携带者。这种情况会让患者及他的亲人感到恐慌。由于一些潜在的疾病会有遗传特性,他们的子女会产生一些负面的社会影响,如:保险、就业、耻辱感等。应该让患者自己决定是否接受测序,与患者谈话并签署同意书。
总之,随着全基因组测序技术的进步,测序所需的时间和费用不断在降低,测序技术在临床医学的应用将获得飞速提升。基因测序技术初期应用于噬菌体、细菌、病毒到逐渐应用于动物、植物后应用于人体,都取得了丰硕的成果,加深了对各种生物各项领域的理解,并逐步改造,创造了巨大的科研和社会效益。对人类自身的基因组测序加速了对人类遗传特性、遗传疾病、罕见及常见疾病的发生、发展的理解,并为提高人类的健康事业开辟了一条新的道路。
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[收稿日期]2012-12-17 [修回日期]2013-02-21
编辑/李阳利