试述室间隔室间隔缺损生物标志物蛋白质组学

论文导读：中文摘要6-8ABSTRACT8-11英汉缩略词对照表11-13前言13-17参考文献15-17第一部分血清样品高丰度蛋白质去除策略探讨17-441材料18-231.1血清样本181.2主要试剂18-191.3主要仪器191.4主要溶液配制19-232策略23-302.1血清样本采集232.2混合血清232.3MARS-Human14液相色谱柱去除血清高丰度
摘要：先天性心脏病(Congenital Heart Disease, CHD)是人类最常见的出生缺陷之一,在活产新生儿中发病率估计为4‰-5‰,是婴幼儿期非感染死亡的首位病因。室间隔缺损(Ventricular Septal Defect,VSD)约占CHD的25%-50%,在出生缺陷中占有重要地位。VSD的病因及发病机制十分复杂,可能涉及多种因素、多个基因和多条信号通路的转变,以往的探讨主要集中在遗传基因、环境危险因素领域,但是要完整了解VSD发生的机制,仅把易感基因定位,明确环境危险因素是不够的,必须要了解心脏在向异常分化发育的历程中与之密切相关蛋白质组及其功能。蛋白质组学作为生命科学探讨的一个重要分支进展十分迅速,一系列新技术融入了蛋白质组学探讨中。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术是由美国运用生物系统公司(Appped Biosystems Incorporation,ABI)研发的一种体外多肽同位素标记相对和绝对定量技术,该技术结合串联质谱的策略可对血清、细胞裂解产物等样品进行相对和绝对定量探讨,是一种寻找生物标志物的理想策略。本探讨旨在利用蛋白质组学技术筛选出潜在的VSD生物标志物,为进一步以蛋白组学角度探讨VSD的发病机制以及运用生物标志物孕早期诊断CHD做出基础工作。目的：1.通过比较血清高丰度蛋白去除策略,建立血清蛋白质组学探讨中有效富集低丰度蛋白的策略并评价富集效果。2.运用蛋白质组学技术筛选潜在的VSD血清蛋白标志物,为进一步以蛋白组学角度探讨VSD的发病机制奠定基础。策略：1.分别运用乙腈沉淀法、乙醇沉淀法、MARS-Human14多重亲和去除系统去除血清中高丰度蛋白,利用预制凝胶电泳和双向凝胶电泳评价高丰度蛋白去除情况和低丰度蛋白富集效果。2.收集VSD患者血清和与之相匹配的健康对照者、房间隔缺损患者、法洛氏四联症患者血清各15例,组内等量混合后利用MARS-Human14多重亲和去除系统去除14种高丰度蛋白,运用iTRAQ试剂标记后进行二维液相色谱分离,串联质谱鉴定VSD相关差别蛋白,并进行生物信息学浅析。结果：1.三种策略均有去除血清高丰度蛋白作用,但乙腈沉淀法和乙醇沉淀法在去除血清高丰度蛋白的同时亦造成低丰度蛋白的丢失,其中乙腈沉淀法以丢失较高分子量蛋白为主,乙醇沉淀法以丢失低分子量蛋白为主。MARS-Human14多重亲和去除系统在特异地去除血清高丰度蛋白的同时使低丰度蛋白得到有效富集。2.质谱鉴定出置信度95%的蛋白质共329种,其中表达量有显著差别的蛋白质有26种,VSD组较健康对照组、房间隔缺损组、法洛氏四联症组表达量均上调1.3倍的蛋白有15种,下调0.78倍的蛋白有11种。生物信息学浅析发现这些差别蛋白主要参与的生物学历程109个、细胞成分23个、分子功能17个、代谢通路2条,预测相互作用蛋白50个。结论：1. MARS-Human14多重亲和去除系统是血清蛋白质组学探讨中富集血清低丰度蛋白的有效策略。2.筛选出一系列对VSD患者具有潜在标志作用的血清差别表达蛋白,为进一步利用生物标志物探讨VSD的发病机制奠定基础。关键词：先天性心脏病论文室间隔缺损论文同位素标记相对和绝对定量技术论文蛋白质组学论文血清蛋白标志物论文
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ABSTRACT8-11
英汉缩略词对照表11-13
前言13-17
参考文献15-17
第一部分 血清样品高丰度蛋白质去除策略探讨17-44
1 材料18-23

1.1 血清样本18

1.2 主要试剂18-19

1.3 主要仪器19

1.4 主要溶液配制19-23

2 策略23-30

2.1 血清样本采集23

2.2 混合血清23

2.3 MARS-Human 14液相色谱柱去除血清高丰度蛋白23-24

2.4 乙腈沉淀法24-25

2.5 乙醇沉淀法25

2.6 运用4%～12%NuPAGE(?)Novex(?)Bis-Tris预制SDS-PAGE比较三种策略血清高论文导读：色谱柱去除血清高丰度蛋白HPLC结果523.2预处理样品蛋白含量测定结果523.3预制凝胶验证各组血清样品高丰度蛋白去除效果52-533.4质谱验证样品胰蛋白酶酶解效果533.5SCX分离结果53-543.6质谱鉴定结果543.7生物信息学浅析54-724讨论72-775结论77参考文献77-81综述81-89参考文献86-89攻读学位期间发表的学术论文目录89-9
丰度蛋白去除效果25-26

2.7 利用2-DE比较三种策略血清高丰度蛋白去除效果26-30

3 结果30-33

3.1 运用MARS-Human 14液相色谱柱去除血清高丰度蛋白HPLC结果30

3.2 BCA法测样品蛋白含量30

3.3 预制凝胶电泳结果30-32

3.4 2-DE结果32-33

3.5 软件浅析结果33

4 讨论33-41
5 结论41
参考文献41-44
第二部分 室间隔缺损血清蛋白标志物的蛋白质组学浅析44-81
1 材料45-47

1.1 探讨对象45

1.2 主要试剂45-46

1.3 主要仪器46

1.4 主要溶液配制46-47

2 策略47-52

2.1 血清样本采集47

2.2 血清样品预处理47-48

2.3 2D-Quant蛋白定量试剂盒测定血清样品处理前后蛋白含量48

2.4 冻干48

2.5 运用4%～12%NuPAGE(?)Novex(?)Bis-Tris预制胶验证血清高丰度蛋白去除效果48-50

2.6 胰蛋白酶酶解、iTRAQ标记50

2.7 离线二维液相色谱分离与点靶50-51

2.8 质谱检测数据采集与处理51-52

2.9 生物信息学浅析52

3 结果52-72

3.1 运用MARS-Human 14液相色谱柱去除血清高丰度蛋白HPLC结果52

3.2 预处理样品蛋白含量测定结果52

3.3 预制凝胶验证各组血清样品高丰度蛋白去除效果52-53

3.4 质谱验证样品胰蛋白酶酶解效果53

3.5 SCX分离结果53-54

3.6 质谱鉴定结果54

3.7 生物信息学浅析54-72

4 讨论72-77
5 结论77
参考文献77-81
综述81-89
参考文献86-89
攻读学位期间发表的学术论文目录89-90
致谢90-91