探讨曲霉曲霉泛素结合酶基因克隆与生物信息学

论文导读：-261.1泛素结合酶的相关知识12-151.1.1泛素化历程121.1.2E2蛋白结构特点及种类12-131.1.3E2蛋白功能13-141.1.4展望14-151.2实验所用毕赤酵母背景15-161.2.1巴斯德毕赤酵母的生物学特性151.2.2巴斯德毕赤酵母体现型15-161.2.3巴斯德毕赤酵母的表达载体161.3植物与盐胁迫16-231.

3.1植物对盐胁迫的反应17-181.2

摘要：盐胁迫是抑制植物生长，降低农作物产量的主要环境因素之一。长期以来，关于如何提升植物的抗盐性，增加在盐胁迫下农作物的产量一直是人们关注的焦点。基于以上事实，培养出抗盐植物对人类的生产生活已经迫在眉睫。本论文基于的实验是抗盐曲霉的泛素结合酶基因的克隆，浅析该克隆基因，以期对转基因植物等基因工程方面做出贡献。本论文中曲霉生理小种鉴别等试验条件及材料由吉林大学植物科学学院张世宏实验室提供。实验材料曲霉具有极强的抗盐性，预示着曲霉可能有着调控或者直接赋予其抗盐功能的多类基因。其中泛素——蛋白酶系统统在生物的生长和发育历程中扮演着重要角色，不仅保证植物的正常生理机能，而且维持植物在逆境中基本存活状态。泛素结合酶可终止对靶蛋白的降解，决定靶蛋白的调控。所以泛素结合酶是细胞代谢中其重要作用的决定因子。基于泛素结合酶独特的抗盐功能，本探讨以对曲霉进行总RNA的提取，反转录成总cDNA，根据文库测序已知的5’序列，通过3’RACE，扩增出缺失序列，拼接，获得该曲霉的全长拼接基因，根据该拼接基因设计E2的全长基因特异性引物，扩增测序的结果与拼接结果比较，结果在可信范围百分比内，获得全长基因。综上所述，曲霉ESTs序列中发现的这个包含泛素结合酶功能域的cDNA序列，经文库筛选，测序鉴定和生物信息学浅析，推测克隆得到的基因为泛素结合酶基因。构建真核表达载体，预计利用农杆菌介导的转化技术对拟南芥进行侵染，以而达到遗传转化的目的，并得到遗传上纯和的转基因植物。对推测克隆得到的泛素结合酶基因进行生物信息学浅析，获得以下信息：1.曲霉UBE2的分子量大小为16.6ku,其碱性氨基酸（K、R）、酸性氨基酸（D、E）、疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）和极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）含量分别为15、16、45和41个，等电点为PH6.4。2.曲霉UBE2序列的第62～64nt处是该cDNA序列的第一个子，第62～505nt处是一个完整的ORF，编码一个147AA的蛋白序列。3.以克隆得到的cDNA推导出的氨基酸序列为探针对GenBank中的非冗余蛋白质数据库进行BlastP浅析，结果发现玉米（Zea mays）﹑酿酒酵母﹑斑马鱼（Daniorerio）﹑日本凋毛藻（Griffithsia japonica）﹑拟南芥和牛（Bos taurus）的泛素结合酶基因的序列一致性分别为84﹪﹑83﹪﹑85﹪﹑88﹪﹑80﹪和83﹪。4.预测结果中E2的α螺旋约占33.33﹪,β延伸链约占19.05﹪，无规则卷曲占47.62﹪。5.对曲霉E2保守结构域的浅析，显示曲霉E2第4～136位属于泛素结合酶家族，第74～89位为泛素结合酶活性位点并具有下列保守序列［FYWLSP］-H-［PC］-［NHL］-［LIV］-x（3,4）-G-x-［LIVP］-C-［LIV］-x(1,2)-［LIVR］。综合生物信息学浅析结果推测，泛素结合酶基因的超量表达可能通过调节靶蛋白的活性，以而调控转基因植物的胁迫响应。关键词：曲霉论文泛素结合酶论文克隆论文生物信息学浅析论文
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Abstract10-12
1 文献综述12-26

1.1 泛素结合酶的相关知识12-15

1.1 泛素化历程12

1.2 E2 蛋白结构特点及种类12-13

1.3 E2 蛋白功能13-14

1.4 展望14-15

1.2 实验所用毕赤酵母背景15-16

1.2.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特性15

1.2.2 巴斯德毕赤酵母体现型15-16

1.2.3 巴斯德毕赤酵母的表达载体16

1.3 植物与盐胁迫16-23

1.3.1 植物对盐胁迫的反应17-18

1.3.2 盐胁迫对植物生理生化特性的影响18-19

1.3.3 植物对盐胁迫的适应机制19-23

1.4 本探讨的目的与作用23-26

1.4.1 本探讨的目的与作用23-24

1.4.2 本探讨的立题依据24-26

2 材料与策略26-36

2.1 材料26-27

2.

1.1 cDNA 文库、载体及菌种26

2.

1.2 主要试剂26

2.

1.3 主要仪器设备26

2论文导读：隆36-373.1.4UBE2序列生物信息学浅析37-383.2后续的转基因任务383.2.1参考PBI121结构图（图6），构建真核表达载体383.2.2转化农杆菌383.2.3复验酵母转化子383.3实验结果38-424实验浅析及讨论42-464.1曲霉泛素结合酶基因的生物信息学浅析42-444.1.1ProtParam浅析结果424.1.2ORFFinder浅析结果424.1.3BlastP和
.

1.4 主要溶液和和培养基的配制26-27

2.2 实验策略27-36

2.1 毕赤酵母高效转化案例制作转化子27-28

2.2 酵母感受态细胞的制备28

2.3 提取 RNA28-29

2.4 RNA 反转录成 DNA29

2.5 3′RACE29-30

2.6 PCR 扩增程序30

2.7 琼脂糖凝胶 DNA 回收30-31

2.8 pMD18-T 的连接31

2.9 大肠杆菌热击感受态的制备（DH5α）31-32

2.10 重组质粒转化 E.cop. DH5α32

2.11 质粒的提取32

2.12 以 cDNA（30×）为模板，进行基因全长的扩增32-33

2.13 双酶切历程（6 小时）33

2.14 PCR 产物或者酶切片段等 DNA 纯化操作步骤33

2.15 构建真核表达载体的连接系统33-34

2.16 农杆菌感受态的制备34

2.17 农杆菌感受态的冻融转化34

2.18 复验酵母转化子34-36

3 实验内容及结果36-42

3.1 曲霉泛素结合酶基因的克隆与序列浅析36-38

3.

1.1 曲霉泛素结合酶基因的抗盐筛选36

3.

1.2 曲霉 RNA 的提取与反转录36

3.

1.3 曲霉泛素结合酶基因全长的克隆36-37

3.

1.4 UBE2 序列生物信息学浅析37-38

3.2 后续的转基因任务38
3.

2.1 参考 PBI121 结构图（图 6），构建真核表达载体38

3.

2.2 转化农杆菌38

3.

2.3 复验酵母转化子38

3.3 实验结果38-42
4 实验浅析及讨论42-46

4.1 曲霉泛素结合酶基因的生物信息学浅析42-44

4.

1.1 ProtParam 浅析结果42

4.

1.2 ORF Finder 浅析结果42

4.

1.3 BlastP 和 ClustalW 浅析结果42-43

4.

1.4 蛋白质二级结构预测43

4.

1.5 CDD 和 ScanProsite 进行功能结构域浅析结果43-44

4.1.6 利用Swiss-model和swiss-pdbviewer软件进行三维结构预测与三维结构浅析的结果44

4.2 讨论44-46

参考文献46-54
硕士期间发表文章54-55
致谢55