简析纯化灵芝多糖固态发酵及降血糖作用初步

论文导读：
摘要：灵芝多糖是灵芝的主要有效成分，具有抗肿瘤、免疫调节、降血脂、降血糖、抗氧化和抗衰老等作用，现已广泛运用于医药、食品、化妆品及临床治疗等方面。目前国内灵芝多糖的生产以子实体栽培和深层培养技术为主。本课题利用固体发酵技术生产灵芝多糖，与传统子实体栽培相比具有难度低、生产周期短、规模可大可小、同等设备产出量高的优点。而与液体发酵生产菌丝相比，又有投资少、占地少、设备和工艺简单、风险小、产品无异味、次生代谢产物积累时间长和培养料来源广泛等优点。以苯酚硫酸法为灵芝多糖测定策略，探讨了以固体发酵灵芝菌丝体中提取水溶性多糖的工艺。通过对浸提历程中的温度、时间、固液比及提取次数的单因素试验和温度、时间、固液比的三因素三水平正交试验，得到灵芝多糖的最佳提取条件为浸提温度85℃，浸提时间50 min，固液比1：70和提取次数为1次。并通过浓度系列梯度的乙醇沉淀，确定灵芝菌丝多糖的最佳醇提浓度为90％。对A、B、麸皮、木薯渣、魔芋粉五种原料进行两两配比实验，以发酵菌丝产灵芝多糖含量为筛选目的，确定出最佳固态发酵物为A与B，理想配比为1：4。在确定最佳固态发酵物的基础上进行不同添加物对产糖的影响探讨，分别添加葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、果胶、木糖、甘露糖、果糖9种糖及KH_2PO_4、K_2HPO_4、MgSO_4 3种盐类至固体发酵物中，证明了通过添加这些物质对产糖无推动作用。通过响应面法中心组合设计实验(R)进一步优化，得到培养基A：B配比为7.6：23.1，同时确定最佳加水量为固水比1：2，接种量10％，产糖时间12d。在此条件下发酵验证，得到灵芝多糖达160 mg/g干菌丝左右，菌丝产量达15.6％。通过Sephadex G-25、乙醇分级沉淀和Sephadex G-200分离纯化灵芝菌丝多糖，得到纯多糖GLPⅠ_(50)，占总多糖含量的81.74％。采取Sephadex G-100凝胶色谱法和薄层层析法进行分子量测定和单糖浅析，初步判断GLPⅠ_(50)由葡萄糖和半乳糖组成，分子量约为185 000 Da，分子量分布54 000 Da-301 000 Da左右。采取四氧嘧啶诱导小鼠造成糖尿病模型，初步探讨了灵芝多糖GLPⅠ_(50)、灵芝菌丝体和灵芝固体培养物对造型后的糖尿病小鼠及正常小鼠的影响。造型后糖尿病小鼠血糖显著升高(P＜0.05)，而造型后给予GL论文导读：
PⅠ_(50)、灵芝菌丝体和灵芝固体培养物均可显著制约血糖升高(P＜0.05)，且在停止给予后仍有一定的制约作用(P＜0.05)，同时GLPⅠ_(50)对正常小鼠没有毒性。关键词：灵芝多糖论文提取论文固体发酵论文分离纯化论文血糖论文
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Abstract8-10
1 引言10-20

1.1 灵芝多糖的组成、结构和种类10-12

1.1 子实体多糖11-12

1.2 菌丝多糖12

1.2 灵芝多糖的生物活性12-15

1.2.1 抗肿瘤活性12-13

1.2.2 免疫调节作用13-14

1.2.3 降血糖作用14-15

1.2.4 其他作用15

1.3 灵芝多糖的发酵策略15-16

1.4 影响发酵法生产灵芝多糖的因素16-17

1.4.1 碳氮源16

1.4.2 无机盐16

1.4.3 pH16

1.4.4 温度16-17

1.4.5 时间17

1.4.6 接种量17

1.4.7 生长因子17

1.5 灵芝多糖的提取17

1.6 灵芝多糖的分离纯化17-18

1.6.1 季铵盐沉淀法17-18

1.6.2 分解沉淀或分级溶解法18

1.6.3 离子交换色谱18

1.6.4 纤维素柱色谱18

1.6.5 凝胶柱色谱18

1.7 灵芝多糖的结构及组分浅析18-19

1.8 灵芝多糖的运用19

1.9 探讨目的和作用19-20

2 材料与策略20-25

2.1 材料20-21

2.

1.1 菌种20

2.

1.2 实验动物20

2.

1.3 主要试剂20

2.

1.4 主要仪器设备20

2.

1.5 培养基20-21

2.2 策略21-25

2.1 灵芝多糖的测定策略(苯酚-硫酸法)21

2.2 菌种活化21

2.3 液体种子培养21

2.4 灵芝菌丝体水溶性多糖的浸提条件探讨21-22

2.4.1 浸提温度选择实验21

2.4.2 浸提时间选择实验21

2.4.3 固液比选择实验21-22

2.4.4 提取次数选择实验22

2.4.5 正交实验22

2.5 浸提率计算22

2.6 灵芝多糖最佳醇提浓度的实验22

2.7 最佳固态发酵物的确定22

2.8 不同糖类添加物对产糖的影响22

2.2.9 培养论文导读：提取的影响25-263.2.2浸提时间对多糖提取的影响263.2.3固液比对多糖提取的影响26-273.2.4浸提次数对多糖提取的影响273.3正交实验结果与浅析27-293.4灵芝多糖最佳醇提浓度实验结果293.5最佳固态发酵物的确定29-303.6不同糖类添加物对产糖的影响30-313.7培养基配比的响应面优化31-333.8最佳加水量、接种量及最佳产糖
基配比的响应面优化22

2.10 最佳加水量、接种量及最佳产糖时间的确定22-23

2.11 灵芝菌丝多糖的分离纯化23

2.2.1

1.1 灵芝多糖的初步分离23

2.2.1

1.2 乙醇分级沉淀及不同多糖级分的凝胶色谱行为23

2.2.12 纯度测定23

2.13 平均分子量的测定23

2.14 GLP I 50单糖组成的初步鉴定23

2.15 灵芝多糖对实验性糖尿病小鼠血糖的影响23-25

2.15.1 糖尿病模型制备23-24

2.15.2 小鼠实验分组24

2.15.3 血糖测定策略及原理24

2.15.4 小鼠的降血糖实验24-25

3 结果与浅析25-47

3.1 葡萄糖标准曲线的制作25

3.2 多糖浸提条件单因素选择实验结果浅析25-27

3.

2.1 浸提温度对多糖提取的影响25-26

3.

2.2 浸提时间对多糖提取的影响26

3.

2.3 固液比对多糖提取的影响26-27

3.

2.4 浸提次数对多糖提取的影响27

3.3 正交实验结果与浅析27-29

3.4 灵芝多糖最佳醇提浓度实验结果29

3.5 最佳固态发酵物的确定29-30

3.6 不同糖类添加物对产糖的影响30-31

3.7 培养基配比的响应面优化31-33

3.8 最佳加水量、接种量及最佳产糖时间的确定33-35

3.9 灵芝菌丝多糖的分离纯化结果35-39

3.9.1 灵芝多糖的初步分离35

3.9.2 乙醇分级沉淀35-36

3.9.3 不同灵芝多糖级分的凝胶色谱组分浅析36-39

3.10 纯度鉴定结果39-40

3.11 平均分子量的测定40-42

3.1

1.1 葡聚糖 Dextran系列标准曲线的制作40-41

3.1

1.2 灵芝多糖平均分子量的测定41-42

3.12 GLP I_(50)单糖组成的初步鉴定42-43

3.13 灵芝多糖对实验性糖尿病小鼠血糖的影响43-47

4 小结47-48
5 讨论48-51

5.1 多糖提取条件的选择48

5.2 多糖含量的测定48-49

5.3 灵芝固体培养的扩大化培养49

5.4 灵芝多糖分子量的测定和单糖浅析49

5.5 实验中尝试的添加物探讨49

5.6 对动物实验的深思49

5.7 进一步探讨的方向49-51

参考文献51-55
致谢55-56
附录56