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谈乙型肝炎乙型肝炎治疗耐药基因突变焦磷酸测序诊断技术流程

最后更新时间:2024-03-14 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:7592 浏览:21274
论文导读:9-503结果50-524讨论52-54小结54-55参考文献55-61个人简历和探讨成果61-62致谢62
摘要:目前检测乙肝病毒耐药突变的策略主要有直接测序法、线性探针浅析法、限制性片段长度多态性浅析及基因芯片等技术。上面陈述的策略都是基于PCR基础上的操作,且只有YMDD耐药突变的实时荧光定量PCR检测技术运用于临床进行定性检测,尚无比较全面和满意的针对多种耐药基因突变定性和定量检测变异株的策略。焦磷酸测序技术具有准确率高,灵活性大,重复性强,操作简单等优势,已经广泛运用于多个探讨领域,尤在SNP浅析方面有较大的技术优势。借助焦磷酸测序技术的进展,建立焦磷酸测序技术检测拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝所致乙肝病毒基因耐药突变的定量检测策略,为临床乙肝耐药诊断和治疗提供依据。针对乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4个常见基因突变位点的6种突变形式,分别克隆构建野生型和突变型质粒作为标准品,运用生物信息学手段设计目标基因通用PCR引物和各突变点的焦磷酸测序引物,建立焦磷酸测序的突变检测策略。对接受拉米夫定、阿德福韦酯治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本进行检测。构建了乙肝病毒四种常见耐药性突变的标准株和变异株克隆,建立了分别或同时检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变的焦磷酸测序策略,对72例临床耐药或疑似耐药的患者血清标本进行检测,双脱氧测序验证,检出拉米夫定耐药突变32例,阿德福韦酯耐药突变5例,其中焦磷酸测序检出20例为混合突变,而双脱氧测序显示为6例。结合临床资料进行浅析,拉米夫定治疗组耐药突变率与Lok AS的探讨结果一致,数据显示拉米夫定治疗组耐药发生率较高,一年期耐药发生率为25%,两年期为46%,其中rtM204V/I(即YMDD)耐药发生最普遍, rtL180M突变率较低,且rtL180M突变均伴随着rtM204V突变。在所检测阿德福韦酯治疗组患者中耐药发生率较低,其中rtN236T没有检出。成功建立了焦磷酸测序定量检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药基因突变的策略,构建了乙肝病毒耐药基因突变的标准质粒,为临床动态监测乙肝病毒变异病毒株、指导合理用药奠定了基础。关键词:乙型肝炎论文耐药论文基因突变论文焦磷酸测序论文
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中文摘要8-10
ABSTRACT10-13
前言13-15
文献回顾15-30
1 乙肝及乙肝治疗原则与目标15-16
2 核苷类似物的介绍及探讨进展16-21

2.1 核苷类似物作用机理16-19

2.2 核苷类似物探讨进展19-21

3 乙肝治疗药物耐药机制及耐药基因探讨进展21-27

3.1 乙肝治疗药物耐药机制21-25

3.2 乙肝治疗药物耐药基因探讨进展25-27

4 现有的检测耐药突变基因的策略及其局限性27-28
5 焦磷酸测序及其检测原理28-30
实验

一、乙型肝炎耐药基因标准株与突变株的分子克隆30-38

1 材料30-31
2 策略31-32
3 结果32-37

3.1 野生型克隆32-34

3.2 耐药基因rtL180M, rtA181V、rtA181T 突变体的克隆34-35

3.3 耐药基因 rtM204V 和 rtM204I 突变体的克隆35-36

3.4 耐药基因rtN236T 突变体的克隆36-37

4 讨论37-38
实验

二、乙肝治疗药物耐药基因突变的焦磷酸测序策略的建立38-48

1 材料38-40
2 策略40-42
3 结果42-47
4 讨论47-48
实验

三、基于焦磷酸测序的乙肝治疗药物耐药基因突变浅析48-54

1 材料48-49
2 策略49-50
3 结果50-52
4 讨论52-54
小结54-55
参考文献55-61
个人简历和探讨成果61-62
致谢62