试论特异性几个组织特异性启动子分离以及BnLAS基因特异表达站

论文导读：
摘要：本探讨在生物信息学浅析的基础上,以拟南芥和牵牛花植物中克隆了三个叶片特异性启动子,分别构建了这三个启动子与GUS报告基因和BnLAS基因的表达载体并转化拟南芥进行功能验证。取得的主要探讨结果如下：1.叶片特异性启动子的克隆和功能验证根据拟南芥和牵牛花基因组序列设计相应的引物,克隆了三个叶片特异性启动子。将启动子与表达载体pBI121上的GUS报告基因连接后,通过农杆菌介导的遗传转化,获得一定数量的转化植株。取T1代阳性植株材料进行GUS染色观察,发现三个叶片特异性启动子均能够启动GUS基因的表达。其中,在叶片中均能检测到GUS基因的高效表达。在根中均体现为30d和70d无表达,而50d有表达。70d的茎中均未能检测到表达。三个启动子在下胚轴、花器官和角果中的表达方式体现出一定的差别。在下胚轴中,PRbcS-1A在两端都表达,而其它两个启动子只集中在下端表达。在花器官中,PSTP3在花药和柱头有表达,而在花瓣、萼片和雌蕊的花柱上无表达；PRbcS-1A在萼片、柱头和雄蕊上有表达,而花柱上无表达；PpNZIP在萼片、花药、柱头及花柱上均有表达。在角果中,PSTP3在角果皮上有少量表达,而在种子中无表达；PRbcS-1A在角果皮上表达量很高,种子中无表达；PpNZIP在角果皮上少量表达,在种子上也能够表达。2.叶片特异性启动子驱动的BnLAS基因对植物生长发育的影响为了解叶片特异性启动子驱动BnLAS基因对植物生长的影响,构建了这三个叶片特异性启动子驱动BnLAS基因的表达载体用于转化野生型拟南芥。对T0代阳性转化植株的观察发现,由PSTP3和PpNZIP特异性启动子驱动BnLAS基因表达的转基因植物发生了显著的生长发育变化,主要体现为转化植株的育性降低、叶片颜色加深、叶片边缘皱缩、抽薹延迟或不抽薹和分枝数减少。而PRbcS-1A::BnLAS转化野生型拟南芥只得到一株未发生表型变异的阳性苗,目前还不能确定该启动子驱动BnLAS基因对植株生长所产生的影响。关键词：叶片特异性启动子论文LAS基因论文遗传转化论文GUS论文
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Abstract7-9
缩略语表9-10
1 前言10-18

1.1 植物启动子探讨概述10-17

1.1 植物启动子的结构10-12

1.1 转录起始位点10

1.2 TATA框10-11

1.3 一般上游启动子原件11

1.4 特有的上游元件11

1.5 增强子和沉默子11-12

1.2 植物启动子的类型12-17

1.2.1 组成型启动子12

1.2.2 组织特异性启动子12-15

1.2.3 诱导型启动子15-17

1.2 拟南芥LAS以及其油菜同源基因BnLAS探讨介绍17-18

1.3 探讨目的18

2 材料与策略18-28

2.1 实验材料18-20

2.

1.1 植物材料18

2.

1.2 PCR反应的引物18-19

2.

1.3 载体和菌株19-20

2.2 实验策略20-28

2.1 拟南芥基因组DNA和牵牛花基因组DNA的提取20-21

2.2 叶片特异性启动子片段的克隆及连接GUS基因表达载体构建21-25

2.1 PCR反应系统及其程序21-22

2.2 PCR产物的回收纯化22

2.3 目的启动子片段与T载体的连接、转化及鉴定22-24

2.4 启动子片段与表达载体pBI121的连接24-25

2.3 叶片组织特异性启动子连接BnLAS基因表达载体构建25

2.4 表达载体转化根癌农杆菌3101与鉴定25-26

2.5 农杆菌介导的拟南芥遗传转化26-27

2.5.1 野生型拟南芥植株的培养26

2.5.2 野生型拟南芥的农杆菌转化26

2.5.3 抗性植株的筛选26-27

2.6 转基因植株GUS染色27

2.7 Edwards法提取植物DNA27-28

3 结果与浅析28-41

3.1 叶片特异性启动子片段的克隆28-30

3.2 转基因植株的鉴定30-31

3.3 GUS活性浅析31-39

3.3.1 载体SG转化阳性论文导读：启动子驱动的BnLAS基因表达阳性株性状观察39-414讨论41-444.1转基因植株的鉴定结果浅析41-424.2叶片特异性启动子序列浅析424.3特异性启动子表达浅析42-434.4三个叶片特异性启动子表达情况比较浅析43-444.5叶片特异性启动子启动BnLAS基因表达的相关不足445进一步工作设想44-46参考文献46-51致谢51-52附录:相关试剂的配
苗GUS染色32-34

3.2 载体PG转化阳性苗GUS染色34-36

3.3 载体RG转化阳性苗GUS染色36-39

3.4 叶片特异性启动子驱动的BnLAS基因表达阳性株性状观察39-41

4 讨论41-44

4.1 转基因植株的鉴定结果浅析41-42

4.2 叶片特异性启动子序列浅析42

4.3 特异性启动子表达浅析42-43

4.4 三个叶片特异性启动子表达情况比较浅析43-44

4.5 叶片特异性启动子启动BnLAS基因表达的相关不足44

5 进一步工作设想44-46
参考文献46-51
致谢51-52
附录:相关试剂的配制52-53