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简析细胞Rho/ROCK信号通路在晚期糖基化终产物诱导肤微血管内皮细胞形态及功能转变中作用

最后更新时间:2024-02-22 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:10833 浏览:30750
论文导读:中的作用;为了探讨Rho/ROCK介导AGE-HSA引起内皮细胞形态和功能变化的机制,分别观察了抑制ROCK对p38MAPK磷酸化水平的影响,以及抑制p38MAPK磷酸化激活对RhoA、ROCK磷酸化激活的影响。通过上面陈述的探讨试图阐明AGE-HSA对血管内皮细胞形态和功能的影响以及可能的信号转导通路,为进一步阐明与AGE-HSA相关的糖尿病微血管并发症
摘要:探讨目的:本课题拟以肤微血管内皮细胞株(human dermal microvascularendothepal cells,HMVECs)为探讨对象,运用细胞生物学、单层内皮细胞通透性的测定、免疫印迹和激光共聚焦显微镜观察等实验策略和技术,观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)修饰的人血清白蛋白(humanserum albumin,HSA)对HMVECs骨架纤维状肌动蛋白(filamentous actin,,F-actin)形态和定位的影响,以及对单层细胞通透性的作用;选用RhoA的主导失活或组成型激活的重组腺病毒以及ROCK抑制剂处理细胞,探讨Rho/ROCK通路是否参与了AGE-HSA介导的上面陈述的细胞反应;通过免疫印迹检测RhoA和ROCK蛋白及其磷酸化水平的变化,查明RhoA、ROCK的磷酸化激活在其中的作用;为了探讨Rho/ROCK介导AGE-HSA引起内皮细胞形态和功能变化的机制,分别观察了抑制ROCK对p38 MAPK磷酸化水平的影响,以及抑制p38 MAPK磷酸化激活对RhoA、ROCK磷酸化激活的影响。通过上面陈述的探讨试图阐明AGE-HSA对血管内皮细胞形态和功能的影响以及可能的信号转导通路,为进一步阐明与AGE-HSA相关的糖尿病微血管并发症发生进展的机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效手段。探讨策略:AGE-HSA由人血清白蛋白与D-葡萄糖共孵育8周制得。体外培养肤微血管内皮细胞株,分别接种于微孔小皿(petri dish)、双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5 mm,孔径大小0.4μm)和6 cm细胞培养皿上,待细胞长至融合或接近融合后,换无血清培养基继续培养2 h使细胞获得同步生长,然后按实验分组分别处理备用。在各实验分组中,分别用ROCK特异性抑制剂Y-27632、H-1152或p38MP丝裂原激活的MAPK通路上游激酶抑制剂SB203580预处理细胞30 min后,即以不同时间或者浓度的AGE-HSA再孵育;另外,用重组腺病毒RhoA N19的无活性型突变体预转染内皮细胞24 h,继以AGE-HSA再孵育;或重组腺病毒RhoA L63的活性突变体单独转染细胞24 h。用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin、RhoA及其磷酸化蛋白的结构及分布转变;用免疫印迹法检测phospho-p38,RhoA和ROCK及其磷酸化水平的变化,采取多功能蛋白组学影像系统KOD2000R直接成像,以ImageJ软件浅析各组灰度值,β-actin为内参进行校正,以对照组面积灰度值为100%与实验组进行比较;用FITC荧光标记蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,实验结果以Pa变化百分比表示,Pa%=(实验样品Pa值/对照样品Pa值)×100。探讨结果:1.AGE-HSA对HMVECs骨架F-actin形态和单层内皮细胞通透性的影响(1) AGE-HSA对HMVECs细胞骨架F-actin形态的影响AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs骨架肌动蛋白F-actin结构和分布的转变,未经修饰的人血清白蛋白无此作用;正常细胞的F-actin主要分布在细胞周边,线条光滑,完整连续,界限分明。随着AGE-HSA作用时间或浓度的增加,F-actin变得毛糙不规整,出现锯齿样结构,甚至断裂、变细、崩解消散,F-actin在细胞内弥散分布,由非极性单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维逐渐增加,细胞变圆、显著回缩,相邻细胞互相解离,细胞间失去正常连接结构。(2) AGE-HSA对HMVECs通透性的影响AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs通透性的升高。在时间效应组中,HMVECs的通透性随AGE-HSA作用时间的延长显著增高(F=186.746,P<0.01),当AGE-HSA作用1,2,4,8,12 h时,与对照组相比,HMVECs的通透性分别增至113.97±2.68%,149.31±2.48%,169.76±6.21%,191.32±2.14%,196.14±2.43%,且以2 h起,与对照组相比有显著性差别(P<0.05),差别有统计学作用。在剂量效论文导读:;转染无活性的重组腺病毒RhoAN19对内皮细胞的形态无显著影响,但能够显著抑制AGE-HSA引起的F-actin形态的转变及应力纤维的形成。(3)ROCK特异性抑制剂对AGE-HSA引起的HMVECs通透性的影响细胞预处理ROCK特异性抑制剂Y-27632或H-1152均能够使AGE-HSA引起的内皮细胞通透性的升高显著降低(F=863.049,P<0.01),内皮细胞的通透系数
应组中,随着AGE-HSA浓度的增加,HMVECs的通透性显著增加(F=344.582,P<0.01),对照组内皮细胞的通透性为100%,当AGEs为12.5,25,50,100μg/ml时,Pa与对照组相比分别增至117.95±0.99%,152.15±4.51%,191.32±2.14%,199.23±2.54%,且以12.5μg/ml起均与对照组有显著性差别(P<0.05),差别有统计学作用。未经修饰的HSA对内皮细胞通透性(101.57±1.29%)无显著影响,差别均无统计学作用(P>0.05)。2.转变RhoA、ROCK活性对AGE-HSA介导的HMVECs细胞骨架F-actin形态和内皮细胞通透性的影响(1) ROCK特异性抑制剂对HMVECs细胞骨架F-actin形态的影响ROCK特异性抑制剂Y-27632或H-1152预处理细胞30 min,均可显著抑制AGE-HSA对HMVECs骨架结构F-actin的影响;但是细胞先和一定浓度的AGE-HSA孵育一定的时间,再给予ROCK特异性抑制剂孵育,并不能逆转已经发生的F-actin形态的转变。(2)用重组腺病毒转变RhoA活性对HMVECs单层细胞骨架F-actin形态的影响转染活性的重组腺病毒RhoA L63能够引起内皮细胞骨架F-actin轻微锯齿样转变,细胞有轻微的回缩,且有少量应力纤维形成;转染无活性的重组腺病毒RhoA N19对内皮细胞的形态无显著影响,但能够显著抑制AGE-HSA引起的F-actin形态的转变及应力纤维的形成。(3) ROCK特异性抑制剂对AGE-HSA引起的HMVECs通透性的影响细胞预处理ROCK特异性抑制剂Y-27632或H-1152均能够使AGE-HSA引起的内皮细胞通透性的升高显著降低(F=863.049,P<0.01),内皮细胞的通透系数Pa由191.32±4.28%分别降至114.52±2.23%和120.53±1.72%,与单纯AGE-HSA组相比差别有统计学作用(P<0.01),但细胞的通透性并没有降至正常,且与对照组相比差别仍具有统计学作用(P<0.01)。(4)用重组腺病毒转变RhoA活性对HMVECs单层通透性的影响在细胞转染重组腺病毒试验组中,与对照组相比,50μg/ml的AGE-HSA作用8 h可以显著增加单层HMVECs的通透性(209.01±3.34%),差别有统计学作用(P<0.01)。细胞转染活性重组腺病毒RhoA L63后,细胞的通透性也显著增加(187.69±5.83%),差别有统计学作用(P<0.01)。而细胞转染无活性重组腺病毒RhoA N19,对通透性(96.25±1.81%)没有显著影响(P>0.05);细胞先转染无活性重组腺病毒RhoA N19后,再与50μg/ml的AGE-HSA作用8 h,与AGE-HSA作用组(209.01±3.34%)相比内皮细胞通透性(92.90±1.65%)显著降低,差别有统计学作用(P<0.01)。3.AGE-HSA刺激对HMVECs中RhoA、ROCK蛋白表达和磷酸化水平的影响(1) AGE-HSA引起HMVECs内RhoA、ROCK磷酸化水平的转变①AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs内RhoA磷酸化水平的增加AGE-HSA刺激引起RhoA磷酸化水平显著增加,且呈时间(F=2.633,P=0.019)和剂量(F=26.234,P<0.01)依赖性,但对RhoA本身的表达没有显著影响(P>0.05)。在时间效应组中,随着AGE-HSA作用时间的延长,细胞中RhoA的磷酸化水平逐渐增加,与对照组相比,以45 min分钟起差别有统计学作用(P<0.01),至60 min时,到达峰值,随后RhoA磷酸化水平开始缓慢下降,当AGE-HSA作用90 min时与对照组相比差别仍有统计学作用(P<0.05),随着时间延长,RhoA磷酸化水平继续降低,当达到120 min时,与对照组相比虽然没有显著性差别(P>0.05),但RhoA磷酸化水平的绝对值仍然比对照组高。剂量效应组中,随着AGE-HSA浓度的增加,细胞中RhoA的磷酸化水平逐渐增加,当AGE-HSA浓度达到25μg/ml时,与对照组相比,差别具有统计学作用(P<0.05),随着AGE-HSA浓度增加,细胞论文导读:
中RhoA磷酸化水平持续增加,当达到50μg/ml时,细胞中RhoA的磷酸化水平达到峰值,并维持在这一水平,而AGE-HSA对RhoA的表达水平则没有显著的影响(P>0.05)。②AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs内ROCK磷酸化水平的增加AGE-HSA以时间(F=3.247,P=0.044)和剂量(F=17.549,P<0.01)依赖的方式引起ROCK磷酸化水平显著增加,而AGE-HSA对ROCK的表达水平没有显著的影响(P>0.05)。时间效应组中,随着AGE-HSA作用时间的延长,内皮细胞中ROCK的磷酸化水平逐渐增加,与对照组相比,45 min分钟起差别有统计学作用(P<0.05),至60 min时,ROCK磷酸化水平达到峰值(P<0.01),然后开始缓慢下降,但与对照组相比差别仍有统计学作用(P<0.01)。在剂量效应组中,随着AGE-HSA浓度的增加,细胞中ROCK的磷酸化水平逐渐增加,当AGE-HSA浓度达到12.5μg/ml时,与对照组相比,差别具有统计学作用(P<0.05),随着AGE-HSA浓度的增加,细胞中ROCK的磷酸化水平持续缓慢上升。(2)活性或无活性RhoA重组腺病毒对HMVECs内RhoA、ROCK及其磷酸化水平的影响对照组中,RhoA及ROCK均有少量磷酸化,转染活性的重组腺病毒RhoAL63后,RhoA、ROCK的磷酸化水平显著升高,而RhoA、ROCK本身则没有显著变化,单独转染无活性的重组腺病毒RhoA N19,内皮细胞内RhoA、ROCK及其磷酸化水平均没有显著转变,而先转染无活性的重组腺病毒RhoA N19,然后再和AGE-HSA作用,则显著抑制了AGE-HSA引起的RhoA、ROCK磷酸化水平的增加。4.AGE-HSA引起的内皮细胞反应中RhoA、ROCK活性变化与p38 MAPK通路的联系ROCK特异性抑制剂Y-27632或H-1152均能够显著降低AGE-HSA引起的p38MAPK磷酸化水平的增加;同时p38MAPK特异性抑制剂SB203580也能够显著降低AGE-HSA引起的RhoA、Rho激酶磷酸化水平的增加。结论:1.AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs形态和功能的转变。2.RhoA/ROCK信号通路参与了AGE-HSA介导的HMVECs形态和功能的转变,但并不是唯一的通路。3.AGE-HSA通过介导RhoA、ROCK的磷酸化而引起HMVECs形态和功能上的转变。4.在AGE-HSA引起的内皮细胞形态和功能转变历程中,Rho/ROCK信号通路和p38MAPK通路共同参与了这一历程,两者相互影响,可以互相被对方激活,协同引起内皮细胞一系列形态和功能上的转变。关键词:Rho/Rho激酶信号通路论文晚期糖基化终产物论文肤微血管内皮细胞论文细胞骨架肌动蛋白论文p38论文MAPK论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-9
ABSTRACT9-13
前言13-19
材料与策略19-27

1.1 一般实验材料及试剂的配置19-21

1.2 实验仪器及设备21-22

1.3 实验策略22-24

1.4 实验分组24-26

1.5 统计学处理26-27

结果27-51

2.1 正常肤微血管内皮细胞的形态观察27

2.2 AGE-HSA对HMVECs细胞骨架肌动蛋白F-actin分布和形态的影响27-29

2.3 AGE-HSA对HMVECs通透性的影响29-32

2.4 Rho/ROCK通路对AGE-HSA介导HMVECs形态和功能转变的影响32-38

2.5 AGEs诱导的HMVECs内RhoA形态和定位及其磷酸化状态转变38-48

2.6 AGE-HSA诱导的内皮细胞反应中,Rho/ROCK与p38信号通路联系48-51
讨论51-55
结论55-56
参考文献56-62
英文词汇缩略表62-63
硕士期间发表文章63-64
致谢64-67
统计学证明67