简论磷酸化弥漫细胞淋巴瘤细胞株SUDHL2中CD44ICD有着作用及其作用机理初步

论文导读：P化疗,也只能使大约一半的病人获得完全缓解,由此如何提升难治复发性DLBCL的缓解率是临床工作中面对的巨大挑战。国际预后指数(InternationalPrognosticIndexIPI)是临床工作中普遍采取的预后指标,但是因DLBCL的高度异质性,使IPI评分难以对其预后做出准确判断。目前普遍采取的分型是通过cDNA微阵列和寡核苷酸技术,比较未激活
摘要：探讨背景弥漫细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)中最常见的类型之一,占成人淋巴瘤的30%-40%。据不完全统计,中国的发病率更高,约占56%,并且发病率逐年上升。DLBCL具有一定的侵袭性并且高度异质,在临床中予标准的CHOP或是R-CHOP化疗,也只能使大约一半的病人获得完全缓解,由此如何提升难治复发性DLBCL的缓解率是临床工作中面对的巨大挑战。国际预后指数(International Prognostic Index IPI)是临床工作中普遍采取的预后指标,但是因DLBCL的高度异质性,使IPI评分难以对其预后做出准确判断。目前普遍采取的分型是通过cDNA微阵列和寡核苷酸技术,比较未激活B细胞、体外激活B细胞以及正常生发中心B细胞的基因表达图谱做出的分型：生发中心B细胞样(germinal center B-cell-pke, GCB)和活化B细胞样(activated-B-cell-pke, ABC)和第三型。其中GCB型化疗效果好,患者预后佳,ABC型对化疗反映敏感度欠佳,预后差。探讨表明肿瘤细胞的侵袭性和转移与细胞表面的粘附分子密切相关。CD44是一种跨膜型粘附分子,广泛表达与正常细胞和肿瘤细胞表面,参与肿瘤细胞的分化、生长、凋亡等调控。我们前期的探讨也证明,CD44与DLBCL预后密切相关。CD44H或CD44v6表达的DLBCL患者预后差。CD44由信号肽、N-末端细胞外结构域、跨膜结构域和C-末端胞质内结构域四个功能区组成,分子大小为80-90KD。CD44分子的跨膜段含有两个早老因子依赖的酶切位点,近胞浆一侧的位点水解脱落,形成大约12-16KD的CD44胞内结构域(CD44intracellular domain, CD44ICD),随后可进入细胞核内,激活核转录因子kappa-B (nuclear transcription factor κB)等,进行转录调控。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)包括ERK1和ERK2,统称为ERK1/2,相对分子量分别为42KD和44KD,是脯氨酸导向的丝氨酸／苏氨酸激酶,使脯氨酸相邻的丝氨酸／苏氨酸磷论文导读：(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)家族成员之一。当其被激活发生磷酸化后,进入细胞核作用于多种转录因子,推动某些基因的转录与表达。过度活化的ERK1/2与肿瘤的发生有关。Notch受体蛋白是由Notch基因编码的一种跨膜蛋白,由胞外段、跨膜区和胞内段组成。哺乳动物中有着4种Notch受体：Notch1-4。当配体与Notch受体结合后
酸化。是有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成员之一。当其被激活发生磷酸化后,进入细胞核作用于多种转录因子,推动某些基因的转录与表达。过度活化的ERK1/2与肿瘤的发生有关。Notch受体蛋白是由Notch基因编码的一种跨膜蛋白,由胞外段、跨膜区和胞内段组成。哺乳动物中有着4种Notch受体：Notch1-4。当配体与Notch受体结合后,能够产生两次蛋白水解反应。当Y-分泌酶作用其跨膜区时,发生第二次水解反映,释放出游离的Notch蛋白包内段(NICD)。NICD穿过核膜进入细胞核,通过与转录因子结合,调控细胞的增殖、分化、凋亡等。有文献报道如果使Notch-1受体表达下调,可以使NF-κB及其靶基因失活,抑制肿瘤细胞的浸润和转移,推动其凋亡DAPT是一种人工合成的Y-分泌酶抑制剂,是目前公认的Notch受体抑制剂,能有效抑制其水解,阻断其信号通路,以而影响细胞的增殖、分化与凋亡。同时DAPT也能抑制CD44水解出CD44ICD,进而影响相关信号通路。我们前期的试验表明,当加入10uM的DAPT后,CD44ICD和NF-κB的表达显著受抑制,同时也有文献报道,DAPT能使CD44的表达量下调,由此,我们并不能明确CD44阳性的ABC-DLBCL细胞株予DAPT处理后,NF-κB的下降究竟是何者引起：是因为CD44ICD的表达下降引起还是由于Notch信号通路被阻断所引起。探讨目的利用现有的ABC-DLBCL细胞株,通过Western blot的策略,明确各细胞株CD44ICD的细胞亚定位,进而观察其对细胞凋亡的影响。并且探讨DAPT、Notch信号通路和CD44三者之间的联系,明确抑制CD44ICD的产生所产生的蛋白水平的转变,是Notch信号通路和CD44两者之中的哪一个起主导作用,同时观察CD44ICD被阻断后,对细胞凋亡的影响,并为寻找提升DLBCL的缓解率的新策略做提供一些基础资料。策略1、细胞株：ABC-DLBCL细胞株SUDHL2、OCI-Ly3;2、检测细胞表面CD44蛋白的表达：流式细胞仪检测SUDHL2、OCI-Ly3细胞株中CD44的表达情况；3、用不同浓的的DAPT分别处理两株细胞,24、48、72h后,瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学的变化；流式细胞仪检测CD44、CD19、论文导读：
CD20的表达情况；Annexin Ⅴ-FITC联合PI染色检测细胞凋亡情况,Real-time PCR检测Notch-1、CD44ICD基因表达的变化；4、用不同浓度的DAPT处理CD44阳性的的细胞株1h后,检测ERK1/2及磷酸化ERK1/2的表达情况；5、所有数据采取SPSS13.0软件进行统计学浅析；计量资料采取X±S表示。如果数据呈正态分布,采取析因设计和One-Way ANOVA进行浅析,如果数据成偏态分布,采取非参数检验。检验水准为α[=0.05,双侧检验,P0.05有统计学作用。结果1、 CD44的表达水平流式细胞仪检测两细胞株SUDHL2、OCI-Ly3细胞表面CD44的表达,其表达水平分别为98.86%±1.56%、3.66%±3.72%；2、Notch-1受体在Sudhl2细胞株的表达在SUDHL2细胞株中可检测到Notch-1受体的表达；3、DAPT对SUDHL2细胞株的形态及CD44、CD19、CD20表达的影响予0、0.1、1.0、5、10umol/L的DAPT分别作用SUDHL2细胞株,经流式细胞仪检测,不同浓度的DAPT对CD44(F=0.371,P=0.826)、CD19(F=0.164,P=0.954)、CD20(F=0.049,P=0.995)抗原的表达量差别均无统计学作用；DAPT作用不同的时间,CD44(Z=-1.445,P=0.148)、CD19(Z=0.148,P=0.688)、CD20(F=2.494,P=0.130)抗原表达量差别无统计学作用；浓度和时间的交互相应对三者的表达量差别均无统计学作用(F=0.371、0.164、0.049,P=0.826、0.954、0.995)。4、 DAPT对CD44ICD、和Notch-1基因表达的影响不同浓度的DAPT分别作用24h、48h、72h后,不同浓度的DAPT对CD44ICDmRNA (F=0.001,P=I.000)、Notch-1mRNA(F=0.623,P=0.650)表达量差别均无统计学作用；DAPT作用不同的时间,CD44ICDmRNA(F=0.189,P=0.828)、Notch-1mRNA(F=2.830,P=0.73)表达量差别统计学作用,表达量差别无统计学作用；浓度和时间的交互相应对两者的表达量差别均无统计学作用(F=0.002、0.368、0.04论文导读：凋亡论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-8ABSTRACT8-15前言15-19材料19-26一、主要试剂19-20二、主要仪器设备20-21三、抗体21-22四、药物22五、主要试剂配置22-26探讨策略26-35一、细胞培养、传代与冻存26二、流式细胞仪检测CD44分子
9,P=I,000、0.926)5、DAPT对SUDHL2细胞凋亡的影响不同浓度的DAPT作用SUDHL2细胞后对细胞的凋亡差别均无统计学作用(F=I.747,P=0.166)；不同时间点对SUDHL2细胞凋亡差别有无统计学作用(χ‘=1.249,P=0.539))；浓度与时间不有着交互效应(F=0.801,P=0.607)；6、 ERKl/2及磷酸化ERKl、2的检测Western Bloting检测SUDHL2细胞株中有着ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达,予不同浓度的DAPT处理SUDHL2细胞1h后,ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达量没有显著变化。结论1、Υ-分泌酶抑制剂DAPT不能抑制SUDHL2细胞株中CD44的表达,并且对CD19、CD20的表达量无影响,对SUDHL2细胞株形态无显著转变。2、 DAPT对SUDHL2细胞株中CD44ICD mRNA和Notch-1mRNA的表达水平在不同时间点不同的处理浓度不能产生影响3、低浓度DAPT对SUDHL2细胞株不诱导产生凋亡作用；4、 ABC-DLBCL来源的SUDHL2细胞株有着ERK1/2的表达及磷酸化的ERK1/2,当予DAPT抑制CD44ICD分泌后,不能对ERK1/2的表达及磷酸化ER1/2的表达产生影响。关键词：弥漫细胞淋巴瘤论文ERK1/2论文磷酸化ERK1/2论文CD44论文CD44ICD论文DAPT论文Notch-1论文凋亡论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-8
ABSTRACT8-15
前言15-19
材料19-26

一、主要试剂19-20

二、主要仪器设备20-21

三、抗体21-22

四、药物22

五、主要试剂配置22-26

探讨策略26-35

一、细胞培养、传代与冻存26

二、流式细胞仪检测CD44分子表达水平26-27

三、细胞全蛋白提取步骤27

四、BCA法测定提取的蛋白浓度27-28

五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳28-29

六、转膜29-30

七、抗体反应30

八、显影30-31
九、凝胶图象浅析31
十、RNA提取31-32
十

一、反转录合成cDNA32-33

十二、Real-Time PCR3论文导读：RK1/2以及用不同浓度的DAPT抑制CD44ICD分泌后ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达情况的变化45-47讨论47-50全文小结50革新与不足50-51英文缩略51-52参考文献52-57致谢57-60在读期间发表论文情况60-61附件61上一页12345
3-34
十

三、细胞图片染色34

十

四、细胞凋亡34

十

五、统计学浅析34-35

结果35-47

一、不同细胞株CD44表达结果35-36

二、RT-PCR检测SUDHL2细胞株中notch-1基因的表达36

三、不同浓度的DAPT对SUDHL2细胞形态学以及CD44、CD19、CD20抗原表达的影响,和对notch-1和CD44ICD基因表达情况的检测36-42

四、不同浓度的DAPT分别作用细胞24h、48h、72h后,细胞凋亡情况42-45

五、SUDHL2细胞株中ERK1/2、磷酸化ERK1/2以及用不同浓度的DAPT抑制CD44ICD分泌后ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达情况的变化45-47
讨论47-50
全文小结50
革新与不足50-51
英文缩略51-52
参考文献52-57
致谢57-60
在读期间发表论文情况60-61
附件61