阐述石斛密花石斛多糖DDP-1-D分离纯化及结构表征

论文导读：密花石斛多糖在药品领域的开发利用提供科学依据。一.正交设计优选密花石斛多糖提取工艺探讨以提取密花石斛多糖含量为评价指标,采取正交设计试验L9(34),选择温度、加水量(倍)、提取次数及提取时间(h)为考察因素,对影响密花石斛多糖提取工艺的因素进行了探讨。干燥的密花石斛茎粉末依次用丙酮、甲醇索式提取脱脂。取脱脂密花石
摘要：石斛是常用名贵中药材,《神农本草经》更将其列为上品。我国有石斛属(Dendrobium)植物76种以上,其中作为药用的40多种。石斛具有滋阴清热、生津益胃、明目利嗓等功能,用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热等多种病症。现代药理表明,石斛具有治疗白内障、胃肠功能紊乱和降血糖等作用,临床运用广泛。它的有效成分主要是多糖和生物碱,其中多糖由于具有抗氧化、增强免疫力和抗肿瘤作用而成为探讨热点。目前石斛大多来源于金钗石斛、铁皮石斛、细茎石斛及迭鞘石斛等,由于这些药用石斛的资源比较紧张,处于供不应求情况,这对石斛多糖的深入开发探讨不利。密花石斛(Dendrobium densiflorum)在我国的广东、海南、广西等地分布较广,产量相对较高,目前已成为药用石斛的主要代用品之一,被《贵州省中药材标准》(1988版)和《江苏省中药材标准》(1998版)收载。本课题选用密花石斛为原料,采取正交设计试验优选密花石斛水溶性多糖的提取工艺。在此基础上,通过DEAE-52纤维素柱和凝胶柱色谱对总多糖进行纯化,获取密花石斛均一多糖,探讨密花石斛均一多糖的理化性质及相对分子质量、单糖组成等一级结构表征,为进一步探讨密花石斛多糖的药理作用机理奠定物质基础,也可为密花石斛多糖在药品领域的开发利用提供科学依据。一.正交设计优选密花石斛多糖提取工艺探讨以提取密花石斛多糖含量为评价指标,采取正交设计试验L9(34),选择温度、加水量(倍)、提取次数及提取时间(h)为考察因素,对影响密花石斛多糖提取工艺的因素进行了探讨。干燥的密花石斛茎粉末依次用丙酮、甲醇索式提取脱脂。取脱脂密花石斛干燥粉末,按正交设计案例提取,水提醇沉,用Sevag试剂去蛋白。水溶液部分透析,冷冻干燥,获得密花石斛粗多糖,准确称重。按照苯酚-硫酸法检测多糖的含量。各因素对密花石斛多糖提取工艺的影响作用程度分别为加热温度提取次数提取时间加水倍数。由此确定密花石斛多糖较佳提取工艺为90℃、加水20倍、提取3次、每次2h。考虑到能耗与后处理简便起见,最适宜的密花石斛多糖提取工艺条件调整为90℃、加水10倍、提取3次、每次2h。验证试验,结果显示该策略具有良好的重现性(RSD=0.027)。在此工艺条件下多糖提取得率3.15%。二.密花石斛多糖的提取分离纯化及UV, FTIR浅析脱脂密花石斛干燥粉末加10倍量水于干燥的密花石斛残留物中90℃提论文导读：吸收峰为C-O-C环内醚中的C-O伸缩振动和C-O-H的O-H变角振动。3个多糖组分都具有这三组峰,确证为多糖化合物。另外,在1653～1639cm-1处为水的振动吸收峰；938cm-1处吸收峰为a-D-Glc的特点吸收峰,897cm-1吸收峰为β-端基差向异构的C-H变角振动,869和816cm~1是D-Man的特点吸收峰。DDP-1-C,DDP-l-D和DDP-1-E均为含葡聚甘露糖,其糖环
取3次,每次2h。抽滤,滤液合并减压浓缩,加4倍量95%乙醇4℃静置过夜,3000rpm离心5min后,沉淀重复水溶醇沉2次。沉淀用去离子水复溶,用Sevag试剂去蛋白4次,水溶液部分装入透析袋(截留分子量：3500Da)在去离子水中透析48h,透析袋内溶液经10000rpm离心10min,上清液冷冻干燥,获得密花石斛粗多糖DDP, DDP通过DEAE-52纤维素离子交换柱NaCl阶段洗脱分离得中性糖DDP-1以及5个酸性糖DDP-2、3、4、5、6。中性糖组分DDP-1过Sephacryl S-200柱分级纯化后,得DDP-1-A, DDP-1-B, DDP-1-C, DDP-1-D和DDP-1-E。 DDP-1-C、DDP-1-D及DDP-1-E的水溶液,经UV-Vis分光光谱仪扫描,波长范围为200-800nm, DDP-1-C. DDP-1-D和DDP-1-E在260nm处没有吸收峰,说明不含核酸成分；在280nm处,曲线基本上平滑,表明3个多糖组分基本不含蛋白质。密花多糖样品DDP-1-C、DDP-1-D和DDP-1-E分别经FT-IR光谱仪扫描,扫描范围为4000～400cm-1。位于3500-3300cm-1的特点峰是糖分子O-H的伸缩振动,3000～2800cm-1的一组峰是糖分子C-H的伸缩振动,1200-1000cm-1处的吸收峰为C-O-C环内醚中的C-O伸缩振动和C-O-H的O-H变角振动。3个多糖组分都具有这三组峰,确证为多糖化合物。另外,在1653～1639cm-1处为水的振动吸收峰；938cm-1处吸收峰为a-D-Glc的特点吸收峰,897cm-1吸收峰为β-端基差向异构的C-H变角振动,869和816cm~1是D-Man的特点吸收峰。DDP-1-C,DDP-l-D和DDP-1-E均为含葡聚甘露糖,其糖环为吡喃型。三.密花石斛中性多糖DDP-1-D的一级结构表征探讨首次以密花石斛中分离获得均一多糖DDP-1-D,经GPC测定,DDP-1-D的平均分子质量为9440Da,其比旋光度为[α]20D+119.19°。综合各种色谱和光谱浅析UV、IR、TLC、GC-MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR(COSY, TOCSY, HSQC和HMBC),以及高碘酸氧化-Smith降解的浅析结果,可知多糖DDP-1-D是葡聚甘露糖,主要由论文导读：糖和D-甘露糖),其摩尔比为3.8：17.4：1。即DDP-1-D中有着1→3、1→4糖苷键,且1→3糖苷键、1→4糖苷键的摩尔比为1：17.4。其骨架由→4)-α-D-Glcp-(1→、→6)-α-D-Glcp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→和→4)-β-D-Manp-(1→构成。重复结构单元如下所示：→6)-α-D-Glcp-(1→2)-α-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→和n
D-Glc和D-Man按3.01：1比例组成。每摩尔糖残基消耗0.860mol NaIO4,同时每摩尔糖残基生成甲酸0.324mol。由此可推断DDP-1-D中非还原性末端或(1→6)-连接的糖残基占32.4%,(1→2)-/(1→4)-连接的糖残基占21.2%和(1→3)-连接的糖残基所占比例不超过46.4%。氧化产物经还原,水解,乙酰化,所得衍生物用GC-MS浅析。结果发现DDP-1-D高碘酸氧化-Smith降解后的产物有甘油,赤藓醇与己糖(包括D-葡萄糖和D-甘露糖),其摩尔比为3.8：17.4：1。即DDP-1-D中有着1→3、1→4糖苷键,且1→3糖苷键、1→4糖苷键的摩尔比为1：17.4。其骨架由→4)-α-D-Glcp-(1→、→6)-α-D-Glcp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→和→4)-β-D-Manp-(1→构成。重复结构单元如下所示：→6)-α-D-Glcp-(1→2)-α-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→和[→4)-α-D-Glcp-(1→]n结论：本论文用正交设计的策略优选了密花石斛多糖的提取工艺;首次以密花石斛中分离获得均一多糖DDP-1-D,并对其结构进行了表征。为进一步探讨密花石斛多糖的药理作用机理奠定物质基础,也为密花石斛多糖在药品领域的开发利用提供科学依据。关键词：密花石斛论文正交设计论文多糖论文分离论文结构论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要3-6
ABSTRACT6-14
第一章 前言14-27

1.1 石斛多糖药理活性探讨进展14-16

1.1 增强机体免疫力14-15

1.2 抗肿瘤作用15

1.3 抗氧化作用15

1.4 降血糖作用15-16

1.5 抗白内障作用16

1.6 其他16

1.2 石斛多糖结构表征探讨进展16-22

1.2.1 石斛多糖相对分子质量分布和单糖组成17

1.2.2 单糖排列次序及糖苷键连接方式17-19

1.2.3 二维核磁共振谱在多糖结构浅析策略探讨运用19-22

1.3 课题构思22-23

1.3.1 本课题探讨的目的、作用22-23

1.3.2 主要论文导读：质量测定51-524.2.2单糖组分浅析52-534.2.3高碘酸氧化-Smith降解浅析53-544.2.4核磁共振谱浅析544.2.5与碘反应544.3结果与浅析54-654.3.1DDP-1-D的纯度与相对分子质量测定54-564.3.2单糖组成浅析56-594.3.3高碘酸氧化-Smith降解浅析59-604.3.4DDP-1-D的核磁共振浅析60-654.3.5碘反应654.4讨论65-67参考文献67-70
探讨内容23
参考文献23-27
第二章 正交设计优选密花石斛多糖提取工艺探讨27-34

2.1 材料、试剂和仪器27-28

2.

1.1 材料和主要试剂27-28

2.

1.2 仪器28

2.2 策略28-30

2.1 提取历程28

2.2 正交设计黄石斛粗多糖提取历程28-29

2.3 密花石斛多糖含量测定29-30

2.3 结果与浅析30-32

2.3.1 葡萄糖标准曲线30

2.3.2 正交试验结果分30-32

2.4 讨论32-33

参考文献33-34
第三章 密花石斛多糖的提取分离纯化及UV、FTIR浅析34-50

3.1 材料、试剂和仪器34-35

3.

1.1 材料34

3.

1.2 主要试剂和仪器34-35

3.2 策略35-38
3.

2.1 密花石斛多糖提取分离纯化技术路35-36

3.

2.2 提取密花石斛粗多糖DDP36

3.

2.3 DDP的分离纯化36-38

3.

2.4 紫外可见光谱浅析38

3.

2.5 红外浅析38

3.3 结果与浅析38-46

3.1 密花石斛多糖的提取与纯化分离39-40

3.2 密花石斛多糖的紫外可见波谱浅析40-42

3.3 密花石斛多糖的红外波谱浅析42-46

3.4 讨论46-48

参考文献48-50
第四章 密花石斛中性多糖的一级结构表征探讨50-70

4.1 材料、试剂和仪器50-51

4.

1.1 材料50

4.

1.2 主要试剂和仪器50-51

4.2 策略51-54
4.

2.1 DDP-1-D均一性检测和相对分子质量测定51-52

4.

2.2 单糖组分浅析52-53

4.

2.3 高碘酸氧化-Smith降解浅析53-54

4.

2.4 核磁共振谱浅析54

4.

2.5 与碘反应54

4.3 结果与浅析54-65
4.

3.1 DDP-1-D的纯度与相对分子质量测定54-56

4.

3.2 单糖组成浅析56-59

4.

3.3 高碘酸氧化-Smith降解浅析59-60

4.

3.4 DDP-1-D的核磁共振浅析60-65

4.

3.5 碘反应65

4.4 讨论65-67
参考文献67-70
第五章 结论与展望70-72

5.1 结论70-71

5.2 展望71-72

缩略语72-73
攻读期间发表的文章73-74
致谢74-76
附件76