分析多态性TLR4基因编码区非同义SNPs对LPS刺激反应及MFHAS1调控TLR4信号通路中专生

论文导读：LPS刺激小鼠单核巨噬细胞后发现,TLR4信号通路中下游的pP65、pP38、pJUN、pERK均显著升高,同时下游TNF-a、IL-6、IL-12的表达显著上升,由此可以认为MFHAS1在TLR4信号通路中可能起负调控作用。本课题通过不同策略和角度探讨单核巨噬细胞中TLR4介导的天然免疫反应相关信号通路时不同环节变化的机制,结果表明：(1)TLR4基因的三个突
摘要：脓毒症是指机体感染微生物后发生的全身炎性反应综合征,是ICU危重病人死亡重要理由之一。Toll样受体4(Toll pke receptor4, TLR4)相关信号通路在炎症反应中起了举足轻重的作用,由此其功能上的缺陷可能严重影响机体抵抗炎症的免疫反应。TLR4通过病原体相关分子方式(PAMPs)识别病原体微生物,激活并启动细胞内信号转导通路,诱导天然免疫的产生,是脓毒症发生进展的重要病理生理机制。基于目前探讨进展,本课题重点开展了两方面的系统探讨：1.利用生物信息学和基因克隆技术,探讨了TLR4基因编码区发生自然突变的非同义SNPs对LPS刺激的反应,旨在为揭示TLR4基因多态性与脓毒症易感性的相关探讨提供分子生物学基础。2.利用分子生物学技术,探讨一个新的蛋白恶性纤维性组织细胞瘤扩增顺序1(MFHAS1)在LPS/TLR4信号通路中的功能作用,旨在为脓毒症的标靶治疗提供新的思路。主要探讨结果如下：1.利用生物信息学,筛选出人TLR4基因编码区发生自然突变的非同义单核苷酸位点(SNPs)17个,其中胞外区14个,胞内区3个。通过PCR及点突变技术成功构建pEGFP-huTLR4质粒及相关17个自然突变质粒。利用LPS刺激后利用双荧光素酶法检测下游NF-κB报告基因活性,结果显示其中A896G, C1196T,A2081G三个SNPs位点的NF-κB报告基因活性显著降低,而其他SNPs位点NF-κB活性无显著差别。其后利用实时荧光定量PCR策略检测此三个SNP位点下游炎性因子TNF-α、IL-6mRNA表达量均显著降低,进一步验证了该三个SNP位点功能正常与否可影响TLR4信号通路的传递。2.通过实时荧光定量PCR策略,检测发现TLR4基因敲除小鼠的单核巨噬细胞中MFHAS1的表达显著低于野生型小鼠。其后进一步通过RNA干扰技术沉默野生型小鼠单核巨噬细胞中的MFHAS1mRNA表达,利用LPS刺激小鼠单核巨噬细胞后发现,TLR4信号通路中下游的pP65、pP38、pJUN、pERK均显著升高,同时下游TNF-a、IL-6、IL-12的表达显著上升,由此可以认为MFHAS1在TLR4信号通路中可能起负调控作用。本课题通过不同策略和角度探讨单核巨噬细胞中TLR4介导的天然免疫反应相关信号通路时不同环节变化的机制,结果表明：(1)TLR4基因的三个突变位点A896G.C1196T、A2081G是脓毒症发生易感性的重要分子生物学基础；(2)在TLR4信号通路中MFHAS1可能起负调控作用。关键词：Toll样受体4(TLR4)论文单核苷酸多态性(SNP)论文脓毒症论文脂多糖(LPS)论文恶性纤维性组织细胞瘤扩增顺序1(MFHAS1)论文
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中文摘要8-9
Abstract9-11
第一部分 TLR4基因编码区非同义SNPS对LPS刺激反应的探讨11-53

1.1 前言11-13

1.2 材料与策略13-34

1.2.1 实验主要仪器13-14

1.2.2 实验主要试剂与材料14-16

1.2.2.1 菌株与细胞株14

1.2.2.2 实验用质粒14

1.2.2.3 实验用试剂盒14

1.2.2.4 实验用酶14-15

1.2.2.5 一般试剂15-16

1.2.3 主要试剂配制16-18

1.2.4 主要实验策略18-33

1.2.4.1 主要信息资源及浅析工具18

1.2.4.2 huTLR4相关质粒构建18-28

(1) pEGFP-huTLR4基础质粒的构建18-25
(2) huTLR4突变质粒的构建25-28

1.2.4.3 细胞转染28-30

1.2.4.4 双荧光素酶报告基因活性检测30-31

1.2.4.5 Real-time FQ-PCR检测TNF-α、IL-6表达31-33

1.2.5 统计学浅析33-34

1.3 结果34-50

1.3.1 人TLR4基因SNPs的基本概况34-35

1.3.2 huTLR4基因编码区非同义SNP生物信息学浅析35-36

1.3.3 pEGFP-huTLR4基因的构建及鉴定36-40

1.3.4 pEGFP-hu论文导读：F-α、IL-6、IL-12表达682.2.5统计学浅析68-692.3结果69-762.3.1TLR4~(-/-)小鼠腹腔单核巨噬细胞中MFHAS1表达下调69-702.3.2RNA干扰效果检测70-722.3.3TLR4基因敲除后p-P65、p-P38、pJNK、pERK表达减弱72-732.3.4MFHAS1沉默后p-P65、p-P38、pJNK、pERK表达增强73-742.3.5MFHAS1沉默后TNF-α、IL-6、IL-12表达量增加7
TLR4基因相关突变质粒的构建及鉴定40-46

1.3.5 双荧光素酶NF-κ B报告基因活性检测结果46-48

1.3.6 Real-time FQ-PCR检测TNF-α、IL-6变化48-50

1.4 讨论50-53

1.4.1 TLR4基因多态性与脓毒症50

1.4.2 TLR4信号通路与脓毒症50-52

1.4.3 A896G、C1196T、A2081G对LPS刺激呈低反应性52-53

第二部分 MFHAS1调控TLR4信号通路的探讨53-79

2.1 前言53-55

2.2 材料与策略55-69

2.1 实验主要仪器55-56

2.2 实验主要试剂与材料56-57

2.1 实验用小鼠56

2.2 实验用试剂盒56

2.3 WB相关抗体56

2.4 一般试剂56-57

2.3 主要试剂配制57-59

2.4 主要实验策略59-68

2.4.1 小鼠腹腔单核巨噬细胞培养及提取59-60

2.4.2 Real-time FQ-PCR检测MFHAS1表达60-63

2.4.3 RNA干扰技术63-66

2.4.4 WesternBlot印迹66-68

2.2.4.5 Real-time FQ-PCR检测TNF-α、IL-

6、IL-12表达68

2.2.5 统计学浅析68-69

2.3 结果69-76

2.

3.1 TLR4~(-/-)小鼠腹腔单核巨噬细胞中MFHAS1表达下调69-70

2.3.2 RNA干扰效果检测70-72

2.3.3 TLR4基因敲除后p-P6

5、p-P38、pJNK、pERK表达减弱72-73

2.3.4 MFHAS1沉默后p-P6

5、p-P38、pJNK、pERK表达增强73-74

2.3.5 MFHAS1沉默后TNF-α、IL-

6、IL-12表达量增加74-76

2.4 讨论76-79

2.4.1 MFHAS1与LRR结构域76

2.4.2 MFHAS1负调控TLR4信号通路76-79

全文总结79-80
参考文献80-86
综述86-103
参考文献95-103
附录103-104
致谢104-105