简谈霉素代谢工程改造S.ambofaciens工业菌株优化欧典螺旋霉素发酵组分选题

论文导读：素论文生二素链霉菌论文属间接合转移论文基因倍增论文同框敲除论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要5-6Abstract6-10第1章前言10-211.1螺旋霉素介绍101.2螺旋霉素的结构10-131.3螺旋霉素生物合成的相关基因簇13-161.4螺旋霉素
摘要：生二素链霉菌能够合成大环内酯类抗生素螺旋霉素。负责螺旋霉素生物合成的基因序列大部分已经被测序,通过对一些功能基因的序列的比对,我们发现了可能具有编码大环氧化修饰酶功能的两个基因orfl和orf31;可能编码负责N-二转移酶功能的两个基因orf1*c和orf9c。在本实验中,我们首先确定了生二素链霉菌本身拥有的两种抗性,选择得到了大肠杆菌E. cop S17-1-生二素链霉菌的高效转移系统。挑选得到了包含螺旋霉素生物合成有关的基因片段的文库。得到了基因倍增突变株S.pSET-orfl, S.pSET-orfl*c和S.pSET-orf31,其中S.pSET-orf1*c和S.pSET-orf31突变株削弱了对m/z为875杂质的生产能力,S.PSET-orfl突变株只在一定程度上减少了螺旋霉素整体的生产能力。得到基因敲除突变株L-D1, L-D1*c, L-D9c和L-D31, L-D9c得到了m/z为815的中间代谢物,其他的三株敲除突变基本上丧失了对螺旋霉素及一些相关代谢物的生产能力。关键词：螺旋霉素论文生二素链霉菌论文属间接合转移论文基因倍增论文同框敲除论文
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Abstract6-10
第1章 前言10-21

1.1 螺旋霉素介绍10

1.2 螺旋霉素的结构10-13

1.3 螺旋霉素生物合成的相关基因簇13-16

1.4 螺旋霉素在生物体内的合成途径16-20

1.5 探讨的主要作用和内容20-21

第2章 材料和策略21-40

2.1 实验材料21-30

2.

1.1 菌株21-22

2.

1.2 质粒22-23

2.

1.3 引物23-25

2.

1.4 主要仪器25-26

2.

1.5 药品及试剂26-27

2.

1.6 主要的缓冲液和溶剂27-28

2.

1.7 培养基28-29

2.

1.8 抗生素29-30

2.2 实验策略30-40

2.1 Ca法即时感受态的制备30

2.2 Inoue大肠杆菌超级感受态的制备30

2.3 感受态大肠杆菌的细胞转化30-31

2.4 大肠杆菌中质粒DNA的少量提取31

2.5 DNA电泳31

2.6 小片段DNA琼脂糖凝胶回收(一般小于5kb)31-32

2.7 DNA酶切32

2.8 DN段的连接32

2.9 PCR反应系统和PCR反应32-33

2.10 生二素链霉菌总DNA的制备33-34

2.11 生二素链霉菌与大肠杆菌的属间接合转移34-35

2.12 生二素链霉菌的发酵及发酵液的检测35-36

2.13 构建生二素链霉菌基因文库36-39

2.14 文库筛选39-40

第3章 遗传转移系统的建立与优化40-45

3.1 生二素链霉菌S.ambofaciens菌体的抗生素抗性探讨40

3.2 载体的选择40-41

3.3 供体菌的选择41

3.4 大肠杆菌和生二素链霉菌的属间接合转移41-42

3.5 检测接合子42-43

3.6 总结43-45

第4章 基因文库的构建45-57

4.1 螺旋霉素基因组文库的建立45-51

4.

1.1 总DNA的打断45-47

4.

1.2 蔗糖的密度梯度离心47-49

4.

1.3 PJTU2554载体的预处理49

4.

1.4 处理过后的总DNA与载体的连接49-50

4.

1.5 包装转染和文库多样性测试50-51

4.2 生二素链霉菌基因簇的筛选51-56
4.

2.1 原位杂交51-52

4.

2.2 PCR验证和筛选52-56

4.3 小结56-57
第5章 螺旋霉素生物合成基因簇中推测修饰性基因orf1的倍增和敲除57-67

5.1 pSET空质粒导入到链霉菌中的属间接合转移57-59

5.

1.1 S.LpSET菌株的验证和发酵57-58

5.

1.2 突变株发酵和检测58-59

5.2 orf1基因的倍增59-64
5.

2.1 基因的倍增质粒构建的示意图及对策60-61

5.

2.2 基因orf1倍增突变株的筛选和发酵61-62

5.

2.3 发酵液的测定62-64

5.3 orf1基因的敲除64-66
5.

3.1 基因的敲除质粒构建的示意图及对策64-65

5.

3.2 发酵的检测65论文导读：

-66

5.4 小结66-67

第6章 螺旋霉素生物合成基因簇中推测修饰性基因orf1~*c的倍增和敲除67-72

6.1 orf1~*c基因的倍增67-69

6.

1.1 倍增突变株的构建67

6.

1.2 基因orf1~*c倍增突变株的筛选和发酵67-68

6.

1.3 发酵液的测定68-69

6.2 orf1~*c基因的敲除69-71
6.

2.1 orf1~*c基因的双交换敲除构建对策69-70

6.

2.2 发酵液的测定70-71

6.3 小结71-72
第7章 螺旋霉素生物合成基因簇中推测修饰性基因orf9c的敲除与orf31的倍增和敲除72-78

7.1 基因orf9c的敲除72-73

7.

1.1 构建的基因orf9c双交换突变株72-73

7.

1.2 发酵液的测定73

7.2 基因orf31的倍增73-75
7.

2.1 倍增突变株的获得73-74

7.

2.2 发酵液的生测和LC-MS检测74-75

7.3 orf31基因的敲除75-77
7.

3.1 orf31基因的敲除菌株的构建76-77

7.4 小结77-78
第8章 结论与展望78-79
8.1 结论78
8.2 展望78-79
参考文献79-82
致谢82