论脐带猪脐带间充质干细胞分离培养与鉴定设计

论文导读：胞。由于其在临床运用上的巨大潜力,关于人脐带间充质干细胞的探讨很多,但多局限于体外实验,而人的临床实验受到限制,由此,在临床运用前寻找一种大动物模型成为迫切的需要；但在人以外的其他物种相关探讨报道匮乏。猪是除灵长类动物外,在生理和解剖结构上与人类最相似的动物,是一种理想的大动物模型,由此其用于基础论述探讨和临
摘要：脐带间充质干细胞(Umbipcal cord mesnchymal stem cells, UCMSCs)是一种位于脐带沃顿氏胶(Wharton's jelly)内和血管周围,来源于发育早期的中胚层和外胚层,具有自我更新能力和多分化潜能的一类成体干细胞。在体外培养中发现,脐带间充质干细胞具有分化为三个胚层细胞的能力,相对高量表达多能性基因Oct-4,sox-2和Nanog;同时,较低的免疫排斥反应使得脐带间充质干细胞在细胞替代治疗和组织工程方面,成为替代有年龄和疾病限制的骨髓间充质干细胞的种子细胞。由于其在临床运用上的巨大潜力,关于人脐带间充质干细胞的探讨很多,但多局限于体外实验,而人的临床实验受到限制,由此,在临床运用前寻找一种大动物模型成为迫切的需要；但在人以外的其他物种相关探讨报道匮乏。猪是除灵长类动物外,在生理和解剖结构上与人类最相似的动物,是一种理想的大动物模型,由此其用于基础论述探讨和临床运用探讨的潜力巨大。本实验以新生大白猪的脐带为实验材料,比较不同的酶消化法和组织培养法对猪脐带间充质干细胞的分离效果,同时,添加生长因子EGF和bFGF,观察生长因子对脐带间充质干增殖速度和生长状态的影响,在此基础上,确定猪脐带间充质干细胞的培养系统,观察细胞的生长特性。实验还通过免疫荧光和PCR策略,在蛋白水平和分子检测了细胞多能性基因Oct-4,sox-2和Nanog的表达情况,同时跟踪了其表达量的变化及走势。最后,为确定猪脐带间充质干细胞的分化能力,对体外培养的细胞进行了成脂和成软骨的诱导分化。实验结果表明：在原代细胞的分离培养中,胶原酶Ⅰ和透明质酸酶相结合的酶处理策略更适宜于猪脐带间充质干细胞的分离,而通过沃顿氏胶消化法得到的原代细胞纯度更高,且生长能力更强；在观察生长因子EGF和bFGF对猪脐带间充质干细胞增殖速度和生长状态影响的实验中发现,单独添加EGF和bFGF的细胞与对照组相比,无显著变化,而两种因子同时添加的细胞在做生长曲线的检测时,显著高于对照组和单独添加组别,说明EGF和bFGF协同作用可以推动维持细胞本身的自我更新能力；而后对细胞进行传代培养,发现传代培养细胞在接种6-12h后贴壁,细胞单层漩涡状生长,呈现出典型的成纤维样,但少量细胞,呈现出扁平,扩张的形态；细胞具有一定的增殖能力,目前已有培养至13代的细胞,细胞形态维持成纤维样,但增殖速度逐渐下降。在多能性基因的检测中发现,通过免疫荧光的策略,可以看到多能性基因sox-2, nanog和nestin的表达,通过分子水平的检测,可以看到Oct-4,sox-2和nanog的表达,且其表达量随传代次数的增加而减少；最后对猪脐带间充质干细胞进行了成脂和成软骨的诱导分化,通过油红0和阿辛蓝的检测,证明其具有分化为成脂细胞和成软骨细胞的能力。关键词：脐带间充质干细胞论文猪论文多能性论文
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Abstract9-11
1 引言11-19

1.1 间充质干细胞概述11

1.2 骨髓间充质干细胞的探讨历史及近况11-13

1.2.1 骨髓间充质干细胞的探讨历史11

1.2.2 骨髓间充质干细胞的探讨近况11-12

1.2.3 骨髓间充质干细胞的运用前景及有着的不足12-13

1.3 脐带间充质干细胞的探讨历史及近况13-18

1.3.1 脐带间充质干细胞的探讨历史13

1.3.2 脐带间充质干细胞的探讨近况13-15

1.3.3 脐带间充质干细胞在临床上的运用15-17

1.3.4 脐带间充质干细胞在运用中的优势及有着的不足17-18

1.3.5 猪脐带间充质干细胞的探讨进展18

1.4 本探讨的目的和作用18-19

2 材料与策略19-26

2.1 实验材料19-20

2.

1.1 实验动物与试剂19

2.

1.2 实验仪器19-20

2.2 实验策略20-26

2.1 猪脐带间充质干细胞的原代分离、培养20-21

2.2 猪脐带间充质干细胞生长曲线的测定21

2.3 免疫荧光检测21

2.4 猪脐带间充质干细胞RNA的提取及多能性基因的鉴定21-23

2.5 猪脐带间充质干细胞诱导分化23论文导读：

-26
3 结果与浅析26-39

3.1 猪脐带间充质干细胞分离培养策略的比较26-29

3.

1.1 猪脐带间充质干细胞分离中不同酶的作用效果26-27

3.

1.2 不同组织部位和策略对分离猪脐带间充质干细胞的影响27-29

3.2 生长因子对猪脐带间充质干细胞生长的影响29-30

3.3 猪脐带间充质干细胞的形态特点及生长状态30-33

3.4 免疫荧光鉴定结果33-36

3.5 PCR检测结果36

3.6 RT-PCR检测结果36-37

3.7 猪脐带间充质干细胞的诱导分化37-39

3.7.1 诱导成脂分化37

3.7.2 诱导成软骨分化37-39

4 讨论39-42

4.1 猪脐带间充质干细胞分离系统的建立39

4.2 EGF和bFGF联合利用对细胞增殖的影响39-40

4.3 细胞体外培养中形成的克隆样细胞团40

4.4 猪脐带间充质干细胞多能性基因的表达及变化40

4.5 猪脐带间充质干细胞的分化能力40-42

5 结论42-43
致谢43-44
参考文献44-49